植物の青色光受容体のFMN結合ドメインの光化学的および変異解析、光陽子

植物の光受容体の光電池は、UV-A/青色光によって活性化された自己リン酸化セリン - スレオニンプロテインキナーゼです。PASドメインスーパーファミリーのメンバーであるLov1とLov2の2つのドメインは、光陽子による光センシングを媒介します。異種発現研究により、両方のドメインがFMN結合部位として機能することが示されています。3つの植物の青色光受容体、Cry1、Cry2、および光陽性はこれまで特定されてきましたが、これらの光センサーの光活性化の根底にある光化学反応はこれまでのところ説明されていません。ここでは、Avena Sativa PhototropinのLOVドメインが、光に応答した青色光吸光度の喪失と暗闇での青色光吸収型の自発的な回復を特徴とする自己完結型のフォトサイクルを受けることを実証します。光反応の速度定数と量子効率は、LOV1がLOV2よりも低い光感受性を示すことを示しています。両方のLOVドメインに対して生成された光生成物のスペクトル特性は、光式フラビンとフラボタンパク質について見られるものとは無関係ですが、フラビン - シュタニル付加物のスペクトル特性と一致しています。フラビン - チオール付加物は、一般に、タンパク質ジスルフィドのフラボタンパク性触媒還元中に形成される短lif式反応中間体です。部位指向の突然変異誘発により、FMN結合および/または光化学反応性にとって重要であると思われるLOV1およびLOV2の推定色素圏結合部位内のいくつかのアミノ酸残基を特定しました。それらの中には、LOVドメインの光化学反応に重要な役割を果たすCys39があります。Cys39をALAに置き換えると、両方のLOVドメインの光化学反応が廃止されました。したがって、フォトトロピンLOVドメインによる光検知は、FMN発色団とCYS39の間に安定した付加物の形成を介して発生することを提案します。

The plant photoreceptor phototropin is an autophosphorylating serine-threonine protein kinase activated by UV-A/blue light. Two domains, LOV1 and LOV2, members of the PAS domain superfamily, mediate light sensing by phototropin. Heterologous expression studies have shown that both domains function as FMN-binding sites. Although three plant blue light photoreceptors, cry1, cry2, and phototropin, have been identified to date, the photochemical reactions underlying photoactivation of these light sensors have not been described so far. Herein, we demonstrate that the LOV domains of Avena sativa phototropin undergo a self-contained photocycle characterized by a loss of blue light absorbance in response to light and a spontaneous recovery of the blue light-absorbing form in the dark. Rate constants and quantum efficiencies for the photoreactions indicate that LOV1 exhibits a lower photosensitivity than LOV2. The spectral properties of the photoproduct produced for both LOV domains are unrelated to those found for photoreduced flavins and flavoproteins, but are consistent with those of a flavin-cysteinyl adduct. Flavin-thiol adducts are generally short-lifetime reaction intermediates formed during the flavoprotein-catalyzed reduction of protein disulfides. By site-directed mutagenesis, we have identified several amino acid residues within the putative chromophore binding site of LOV1 and LOV2 that appear to be important for FMN binding and/or the photochemical reactivity. Among those is Cys39, which plays an important role in the photochemical reaction of the LOV domains. Replacement of Cys39 with Ala abolished the photochemical reactions of both LOV domains. We therefore propose that light sensing by the phototropin LOV domains occurs via the formation of a stable adduct between the FMN chromophore and Cys39.