内部リボソーム侵入部位（IRES）ビシストロニックmRNAの効率に対するインターシストロニック長の影響

ピコナウイルスのmRNAに見られる特定の構造は、キャップに依存しない翻訳を可能にすることが知られています。内部リボソーム侵入部位（IRE）と名付けられたこれらの構造は、ビシストロンmRNAの2番目のシストロンの翻訳を支持することもできます。それらの作用メカニズムはよく理解されていません。本研究では、2つのIRESが使用されています。ポリオウイルスのIRESと、SV40初期遺伝子からの5 'Pの非翻訳配列、R構造、およびヒト白血病ウイルス1（HTLV-1）のU5領域の小さな部分で構成される新しく発見されたIRES（SUR）が使用されています。最初のシストロンとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むビシストロン構築物と2番目のシストロンとしてのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）は、Rous肉腫ウイルス（RSV）プロモーターによって駆動され、初期遺伝子SV40ターミネーターが含まれていました。得られたすべてのプラスミドは、HELAおよびCHO細胞のトランスフェクションによってテストされました。IRESのないビシストロニックmRNAでは、CAT遺伝子の発現は2つのシストロン間の距離に依存していました。挿入RNAが30〜90ヌクレオチドで構成されている場合、2番目のシストロンの発現の最大効率が得られました。この発現は、挿入断片が8または300ヌクレオチドを含んでいた場合、500ヌクレオチドで検出できなかった場合、深く減少しました。予想外に、ルシフェラーゼmRNAは、挿入RNAが8または30のヌクレオチドの場合、ほとんど発現しませんでした。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、インターシストリックRNA断片が80ヌクレオチドであり、300および500ヌクレオチドで低くなったときに発生しました。ポリオウイルスまたはSUR Iressがインターシストロニックスペーサーの後に追加されたときに同じ観察が行われました。しかし、CAT遺伝子の発現は両方のIRESによって増幅されました。ポリオウイルスまたはシュールが先行する猫のシストロンが、その終了コドンの前に316ヌクレオチドのルシフェラーゼシストロン内に導入されたとき、IRESはmRNAルシフェラーゼ読みフレームの逆に次のCAT遺伝子の翻訳を開始することができました。さらに、これらすべての構成により、CAT Cistronの最高の発現レベルは、CAT Cistronのみを運ぶのと同じベクトルで得られたものの10％を超えませんでした。IRESSとCAPサイトの可能性のある関係を特定するために、IRESの前または非対立のCAT Cistronは、ルシフェラーゼ遺伝子のAUGコドンの210ヌクレオチド（すなわち、CAP部位から258ヌクレオチド）と100ヌクレオチドを追加した後、100ヌクレオチドを導入しました。CAT遺伝子の発現は、ポリオウイルスIRESの添加によって修飾されませんでしたが、Sur Iresによって強く刺激されました（発現レベルは、CAT Cistronのみを運ぶ同じベクターで得られたものの65％に対応していました）。これらの結果は、翻訳を刺激するためにポリオウイルスアイレではなく、CAPとSur Iresの間に協力があることを示唆しています。これらのデータは、Bicistronic mRNAの2番目のCistronの効率的な発現を可能にするために、IRESを正確な位置で導入する必要があることを示しています。

Specific structures found in the mRNA of picornavirus are known to allow a cap-independent translation. These structures, named internal ribosome entry sites (IRES), are also able to favor translation of the second cistron in bicistronic mRNAs. Their mechanism of action is not well understood. In the present study, two IRESs have been used: the IRES from poliovirus and a newly discovered IRES (SUR) composed of the 5' P untranslated sequence from SV40 early genes, the R structure, and a small part of the U5 region from the human leukemia virus-1 (HTLV-1). The bicistronic constructs containing the firefly luciferase gene as the first cistron and the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) as the second cistron were driven by the Rous sarcoma virus (RSV) promoter and contained the early gene SV40 terminator. All the resulting plasmids were tested by transfection in HeLa and CHO cells. In the bicistronic mRNAs without IRES, the expression of the CAT gene was dependent on the distance between the two cistrons. The maximum efficiency in the expression of the second cistron was obtained when the intercalating RNA was composed of 30 to 90 nucleotides. This expression was deeply reduced when the intercalating fragment contained 8 or 300 nucleotides and was undetectable with 500 nucleotides. Unexpectedly, the luciferase mRNA was almost not expressed when the intercalating RNA was of 8 or 30 nucleotides. Expression of the luciferase gene occurred when the intercistronic RNA fragment was of 80 nucleotides and it became lower at 300 and 500 nucleotides. The same observations were done when the poliovirus or the SUR IRESs were added after the intercistronic spacers. However, expression of the CAT gene was amplified by both IRESs. When the CAT cistron preceded by the poliovirus or SUR IRES was introduced within luciferase cistron, 316 nucleotides before its termination codon, the IRESs were able to initiate translation of the following CAT gene irrespectively of the mRNA luciferase reading frame. Moreover, with all these constructs the highest expression level of the CAT cistron did not exceed 10% of that obtained with the same vector carrying only the CAT cistron. To identify a possible relation between the IRESs and the cap site, the CAT cistron preceded or not with an IRES was introduced 210 nucleotides downstream of the AUG codon of the luciferase gene (i.e., 258 nucleotides from the cap site) and 100 nucleotides after an added UAG termination codon. Expression of the CAT gene was not modified by the addition of the poliovirus IRES but it was strongly stimulated by the SUR IRES (the level of expression corresponded to 65% of that obtained with the same vector carrying only the CAT cistron). These results suggest that there is a cooperation between the cap and the SUR IRES and not the poliovirus IRES to stimulate translation. These data indicate that IRESs must be introduced in precise position to allow an efficient expression of the second cistron in bicistronic mRNAs.