リゾチームの構造安定性に対する水/有機溶媒界面の効果

タンパク質の回復と構造の完全性に対する塩化メチレンによるリゾチーム溶液の乳化の効果を調査しました。水相における総リゾチーム回復は濃度に依存していることがわかり、65〜80％の範囲でした。回収されていないリゾチームは、界面で白い沈殿物として観察されました。可溶性リゾチームの構造変化は、酵素活性アッセイ、サイズ排出クロマトグラフィー（SEC）、ゲル電気泳動（SDS-PAGE）、および循環二色性（CD）によって観察されませんでした。凍結乾燥沈殿タンパク質はFTIRによって分析され、分子間ベータシート形成の証拠が見つかりました。さらに、酵素活性アッセイ、CD、SDS-PAGE、およびsec。水性バッファー溶液中のコントロールリゾチームサンプルまたはサンプルに違いは観察されませんでした。これは、リゾチームが乳化時に非共有結合凝集体として沈殿することを示しており、これらの沈殿物は1 mのグアニジン塩酸塩で在来状態に再折り返すことができることを示しています。スクロース、トゥイーン20、またはトゥイーン80の添加により、タンパク質の回復は改善できませんでした。BSAおよび部分的に加水分解ポリビニルアルコール（PVA）などの水/有機溶媒界面を競合する賦形剤により、リゾチームの回収率が95％> 95％に改善されました。有機相でポリ（乳酸 - コグリコール酸）（PLGA）を含むエマルジョンは、非形成不可能なタンパク質回収をもたらしました。ここでも、部分的に加水分解されたPVAは、リゾチームの回復を大幅に増加させました。したがって、塩化メチレンによるリゾチーム含有水溶液の乳化は、不完全なタンパク質回収とリゾチームの非共有凝集を引き起こすことがわかりました。これらの凝集体は、水中の乳化手順を使用して準備された制御された薬物送達システムにもカプセル化されています。部分的に加水分解されたPVAなどの表面活性添加剤を使用すると、リゾチーム凝集が大幅に減少し、不活性および潜在的に免疫原性タンパク質種のカプセル化を防ぐために使用できます。

The effect of emulsification of lysozyme solutions with methylene chloride on protein recovery and structural integrity was investigated. Total lysozyme recovery in the aqueous phase was found to be concentration dependent, and ranged between 65 and 80%. The unrecovered lysozyme was observed at the interface as a white precipitate. No structural changes of the soluble lysozyme were observed by enzymatic activity assay, size-exclusion chromatography (SEC), gel electrophoresis (SDS-PAGE), and circular dichroism (CD). The lyophilized precipitated protein was analyzed by FTIR, and evidence of intermolecular beta-sheet formation was found. In addition, the precipitate was analyzed after redissolution in 1 M guanidine hydrochloride by enzymatic activity assay, CD, SDS-PAGE, and SEC. No differences with control lysozyme samples or samples in aqueous buffer solutions were observed. This indicates that lysozyme precipitates as non-covalent aggregates upon emulsification, and these precipitates can refold into their native state in 1 M guanidine hydrochloride. Protein recovery could not be improved by the addition of sucrose, Tween 20, or Tween 80. Excipients competing for the water/organic solvent interface, such as BSA and partially hydrolyzed polyvinylalcohol (PVA) significantly improved lysozyme recovery to >95%. Emulsions which contained poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) in the organic phase gave irreproducible protein recovery. Here also, partially hydrolyzed PVA significantly increased lysozyme recovery. Thus, we found that emulsification of lysozyme-containing aqueous solutions with methylene chloride causes incomplete protein recovery and non-covalent aggregation of lysozyme. These aggregates are also encapsulated in controlled drug delivery systems which are prepared using a water-in-oil emulsification procedure. The use of surface-active additives, such as partially hydrolyzed PVA significantly reduces lysozyme aggregation, and can be used to prevent encapsulation of inactive and potentially immunogenic protein species.