真核生物のオルニチン脱炭酸酵素の反応特異性の変化

オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）は、ポリアミンの生合成における最初のコミットされたステップを触媒し、ブルーセイトリパノソーマによって引き起こされるアフリカの睡眠病の治療の薬物標的として特定されています。ODCは、ピリドキサール5'-リン酸（PLP）依存性酵素であり、義務的なホモダイマーです。T. brucei野生型酵素の複合体のX線構造分析製品プトレシンは、リガンド結合時に発生する2つの構造的変化を明らかにします：Lys-69はPutrescineによって変位し、Glu-94およびASP-88との新しい相互作用を形成します、およびCys-360の側鎖は、イミン結合の3.4 a以内に活性部位に回転します。Cys-360のALAまたはSERへの変異は、それぞれ脱炭酸反応のK（CAT）を50倍と1000倍減少させます。しかし、産物のHPLC分析は、変異体酵素がほぼ独占的に脱炭酸依存性トランスアミン化反応を触媒し、PLPとプトレシンの代わりにピリドキサミン5-リン酸（PMP）およびガンマ - アミノブチルアルデヒドを形成することを示しています。この副反応は、脱炭酸塩の基質中間体が基質のC（アルファ）ではなくPLPのC4 'でプロトン化されると発生します。野生型酵素によって触媒される反応の場合、この副反応はまれに発生します（売上高の<0.01％）。単一の回転オーバー分析と多波長停止フロー分光研究は、C4 'での変異ODCSプロトン化の場合、脱炭酸との協調反応で発生すること、および定常状態反応の速度制限ステップはシフ塩基加水分解/生成物であることを示唆しています。リリース。これらの研究は、生理学的製品プトレシンの形成を触媒するC（アルファ）プロトン化ステップの制御におけるCYS-360の役割を示しています。この結果は、このクラスのPLP依存性酵素が反応特異性を制御するメカニズムに対する洞察をさらに提供します。

Ornithine decarboxylase (ODC) catalyzes the first committed step in the biosynthesis of polyamines, and it has been identified as a drug target for the treatment of African sleeping sickness, caused by Trypanosoma brucei. ODC is a pyridoxal 5'-phosphate (PLP) dependent enzyme and an obligate homodimer. X-ray structural analysis of the complex of the T. brucei wild-type enzyme with the product putrescine reveals two structural changes that occur upon ligand binding: Lys-69 is displaced by putrescine and forms new interactions with Glu-94 and Asp-88, and the side chain of Cys-360 rotates into the active site to within 3.4 A of the imine bond. Mutation of Cys-360 to Ala or Ser reduces the k(cat) of the decarboxylation reaction by 50- and 1000-fold, respectively. However, HPLC analysis of the products demonstrates that the mutant enzymes almost exclusively catalyze a decarboxylation-dependent transamination reaction to form pyridoxamine 5-phosphate (PMP) and gamma-aminobutyraldehyde, instead of PLP and putrescine. This side reaction arises when the decarboxylated substrate intermediate is protonated at C4' of PLP instead of at the C(alpha) of substrate. For the reaction catalyzed by the wild-type enzyme, this side reaction occurs infrequently (<0.01% of the turnovers). Single turnover analysis and multiwavelength stopped-flow spectroscopic studies suggest that for the mutant ODCs protonation at C4' occurs either very rapidly or in a concerted reaction with decarboxylation and that the rate-limiting step in the steady-state reaction is Schiff base hydrolysis/product release. These studies demonstrate a role for Cys-360 in the control of the C(alpha) protonation step that catalyzes the formation of the physiological product putrescine. The results further provide insight into the mechanism by which this class of PLP-dependent enzymes controls reaction specificity.