DNA Helicase Repa：核酸化物の協調性ATPase活性と結合

ホモヘキサマーDNAヘリカーゼレパのATPase活性の定常状態の運動パラメーターと、蛍光アナログのエプシロナドプのレパへの結合が研究されています。ssDNAは、酸性pH 5.3-6.0で最適にRepa atPaseアクティビティを刺激します。ssDNAの非存在と存在の両方でのS状の運動曲線は、SSDNA刺激ATPase活性に最適なオリゴヌクレオチドが10merより長いATP加水分解に対して強い正の協同性を示しています。蛍光滴定は、25度Cで、DNAの非存在下で、エプシロナドプのレパに対する結合が3つの高さ（k（1）= 1.54 x 10（6）m（-1）と3つの低い（k（2）= 4.71 x 10（4）m（ - 4）m（ - ）補因子が存在しない場合、RepaはT（M）= 65.8 +/- 0.1度Cで協調的に溶け、ATPGAMMAS、T（M）= 68.1 +/- 0.2度C（DELTADELTAG 0.95 KCAL/MOL）の存在下でより安定しています。0.29 kcal/mol）、ATPGAMMASの追加のリン酸基がRepa構造に大きな影響を与えることを示しています。モデルが提案されています。このモデルでは、レパの個々のサブユニットが順次および協力的に多段階のATP加水分解サイクルを実行します。

The steady-state kinetic parameters of the ATPase activity of the homohexameric DNA helicase RepA and the binding of the fluorescent analogue epsilonADP to RepA have been studied. ssDNA stimulates RepA ATPase activity optimally at acidic pH 5.3-6.0. The sigmoidal kinetic curves in both the absence and presence of ssDNA show strong positive cooperativity for ATP hydrolysis, with oligonucleotides longer than 10mer optimal for ssDNA-stimulated ATPase activity. Fluorescence titrations show that, at 25 degrees C and in the absence of DNA, the binding of epsilonADP to RepA is biphasic with three high (K(1) = 1.54 x 10(6) M(-1)) and three low (K(2) = 4.71 x 10(4) M(-)(1)) affinity binding sites differing by 30-40-fold in binding constants. In the absence of cofactors, RepA melts cooperatively at T(m) = 65.8 +/- 0.1 degrees C and is more stable in the presence of ATPgammaS, T(m) = 68.1 +/- 0.2 degrees C (DeltaDeltaG 0.95 kcal/mol), than in the presence of ADP, T(m) = 66. 5 +/- 0.1 degrees C (DeltaDeltaG 0.29 kcal/mol), indicating that the additional phosphate group in ATPgammaS has a significant influence on RepA structure. A model is proposed in which individual subunits of RepA sequentially and cooperatively perform a multistep ATP hydrolytic cycle.