真菌病原体の識別のためのPCRベースのラインプローブアッセイの開発

PCR増幅と組み合わせると、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス種を含む臨床的に重要な真菌病原体を検出および特定する逆ハイブリダイゼーションラインプローブアッセイ（LIPA）について報告します。DNAプローブは、カンジダアルビカンスの内部転写スペース（ITS）領域から設計されています。プローブは、ビオチン化そのPCR産物を検出するためにLIPAに組み込まれ、プローブの特異性を評価しました。C. albicans、A。fumigatus、およびC. neoformansのゲノムDNAの1およびそのアンプリコンの完全なAmpliconsのLipa検出限界を確立しました。LIPAのさらなる評価は、臨床真菌分離株で実施されました。二形性酵母と皮膚染色および糸状菌からなる17個の27個の分離株が、77個の二形酵母と23個の糸状分離株を正しく識別したLIPAによってテストされました。残りの27の分離株は、プローブがLIPAに含まれていない菌類の種を表しています。菌類-PCR-LIPA技術は、以前に記載されたチオシアネートシリカ法または市販のQIAMP組織キットのいずれかによってDNAが抽出され、細胞を機械的に破壊するために、ミニビードビートによって前処理されたカンジダ細胞を接種した血液サンプルに適用されました。抽出されたDNAのPCR増幅およびLIPAアッセイでのその後のDNAプローブハイブリダイゼーションにより、2〜10細胞/mlの検出限界が得られました。PCR阻害を監視するために、内部標準制御がPCR増幅に含まれていました。この真菌PCR-LIPAアッセイは堅牢で敏感であり、真菌感染症の同日診断の可能性を秘めた臨床テスト研究所に簡単に統合できます。

We report on a reverse-hybridization line probe assay (LiPA) which when combined with PCR amplification detects and identifies clinically significant fungal pathogens including Candida, Aspergillus, and Cryptococcus species. DNA probes have been designed from the internal transcribed-spacer (ITS) regions of Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida dubliniensis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans and Aspergillus flavus. The probes were incorporated into a LiPA for detection of biotinylated ITS PCR products, and the specificity of the probes was evaluated. We established LiPA detection limits for ITS 1 and for full ITS amplicons for genomic DNA from C. albicans, A. fumigatus, and C. neoformans. Further evaluation of the LiPA was carried out on clinical fungal isolates. One hundred twenty-seven isolates consisting of dimorphic yeasts and dermatophytic and filamentous fungi were tested by the LiPA, which correctly identified 77 dimorphic yeasts and 23 of the filamentous isolates; the remaining 27 isolates represented species of fungi for which probes were not included in the LiPA. The fungal-PCR-LiPA technology was applied to blood samples inoculated with Candida cells which were pretreated by minibead beating to mechanically disrupt the cells, with the DNA extracted by either a previously described guanidium thiocyanate-silica method or the commercially available QIAmp tissue kit. PCR amplification of the extracted DNA and subsequent DNA probe hybridization in the LiPA assay yielded detection limits of 2 to 10 cells/ml. An internal standard control was included in the PCR amplification to monitor for PCR inhibition. This fungal PCR-LiPA assay is robust and sensitive and can easily be integrated into a clinical-testing laboratory with the potential for same-day diagnosis of fungal infection.