dsred内の発色団の構造、サンゴからの赤い蛍光タンパク質

見事に赤い蛍光タンパク質であるDSREDは、最近、ホモロジーによってDiscosoma Coralからクラゲのエコーレアの緑色蛍光タンパク質（GFP）にクローニングされました。DSREDの生化学の中核的な問題は、GFPのような475 nmの励起と未熟DSREDの500 nmの発光最大値が、558 nmの励起と583 nmの発光最大値に赤方偏移しているメカニズムです。リシルエンドペプチダーゼで成熟DSREDの消化後、精製された発色団を含むペプチドの高解像度質量スペクトルは、一部の分子が、緑のままであるミュータントK83Rから同様に調製したペプチドと比較して2 DAを失っていることを明らかにしています。タンデム質量分析は、GLN-66のアルファ炭素と窒素の間の結合がDSREDで脱水素化されており、イミダゾリジンンの2位でC == n == C == Oを形成することによりGFPクロモフォアを拡張したことを示しています。このアシルイミン置換基は、量子機械的計算に従って赤方偏移を定量的に説明しています。アシルイミンのC == N結合の可逆的水和は、変性が成熟したdsがGFP様吸光度に戻る理由を説明します。c == n結合は沸騰すると加水分解され、DSREDがSDS/ページに2つのフラグメントバンドを表示する理由を説明します。このアッセイは、緑から赤色の発色団への変換が老化した後でも不完全なままであることを示唆しています。

DsRed, a brilliantly red fluorescent protein, was recently cloned from Discosoma coral by homology to the green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea. A core question in the biochemistry of DsRed is the mechanism by which the GFP-like 475-nm excitation and 500-nm emission maxima of immature DsRed are red-shifted to the 558-nm excitation and 583-nm emission maxima of mature DsRed. After digestion of mature DsRed with lysyl endopeptidase, high-resolution mass spectra of the purified chromophore-bearing peptide reveal that some of the molecules have lost 2 Da relative to the peptide analogously prepared from a mutant, K83R, that stays green. Tandem mass spectrometry indicates that the bond between the alpha-carbon and nitrogen of Gln-66 has been dehydrogenated in DsRed, extending the GFP chromophore by forming C==N==C==O at the 2-position of the imidazolidinone. This acylimine substituent quantitatively accounts for the red shift according to quantum mechanical calculations. Reversible hydration of the C==N bond in the acylimine would explain why denaturation shifts mature DsRed back to a GFP-like absorbance. The C==N bond hydrolyses upon boiling, explaining why DsRed shows two fragment bands on SDS/PAGE. This assay suggests that conversion from green to red chromophores remains incomplete even after prolonged aging.