本質的に蛍光タンパク質の分子分光法とダイナミクス：サンゴの赤（DSRED）および黄色（シトリン）

生物系における本質的に蛍光タンパク質の遺伝子発現は、新しい非侵襲的窓を細胞機能に提供しますが、これらのプローブの最適化は、分子分光法、ダイナミクス、および構造の理解に依存しています。ここでは、重要な比較のために、希望の排出/吸収波長（シトリン）（シトリン）（S65G/V68L/Q69 M/S72A/T203Y）の希望の長い放出/吸収波長（シトリン）（シトリン）（シトリン）（シトリン）（シトリン）の光物理学（DSRED）の光物理学が産子腫（サンゴ）を提供します。、蛍光相関分光法と時間相関単一光子カウントを使用することで特徴付けられます。DSRED蛍光は、3.65 +/- 0.07-NS時定数で単一の指数として減衰し、シトリンとは対照的に、pH 4.4-9.0に依存しない単一の放出状態/種を示しています。ただし、レーザー励起は、一定のパーティション分率F（1）= 0.42 +/- 0.06と約3 x 10（-3（-3）で、暗い状態と明るい状態の間の10（3）-10（4）Hzで可逆的な蛍光フリッカーを駆動します。）。シトリン（PKA約5.7）とは異なり、DSREDではpH依存性プロトン結合は無視できます（pH 3. 9-11）。DSREDの時間分解異方性により、シトリンの単一回転時間（16 +/- 2 ns）とは対照的に、急速な脱分極（211 +/- 6 PS）と遅い回転運動（53 +/- 8 ns）が明らかになります。回転および翻訳の拡散から計算された分子寸法は、DSREDがモノマーの予測よりも半流体力学的に3.8 +/- 0.4倍大きいことを示しています。高速脱分極は、24 +/- 3度の脱分極角を意味する初期異方性を備えたモバイル非平行発色団の間のオリゴマー内エネルギー移動に起因します。大きな2光子励起断面（DSREDの場合は990 nmで約100 gm、シトリンの場合は970 nmで約50 gm）、細胞内の2光子蛍光イメージングで有利であると測定されます。

Gene expression of intrinsically fluorescent proteins in biological systems offers new noninvasive windows into cellular function, but optimization of these probes relies on understanding their molecular spectroscopy, dynamics, and structure. Here, the photophysics of red fluorescent protein (dsRed) from discosoma (coral), providing desired longer emission/absorption wavelengths, and an improved yellow fluorescent protein mutant (Citrine) (S65G/V68L/Q69 M/S72A/T203Y) for significant comparison, are characterized by using fluorescence correlation spectroscopy and time-correlated single-photon counting. dsRed fluorescence decays as a single exponential with a 3.65 +/- 0.07-ns time constant, indicating a single emitting state/species independent of pH 4.4-9.0, in contrast with Citrine. However, laser excitation drives reversible fluorescence flicker at 10(3)-10(4) Hz between dark and bright states with a constant partition fraction f(1) = 0.42 +/- 0.06 and quantum yield of approximately 3 x 10(-3). Unlike Citrine (pKa approximately 5.7), pH-dependent proton binding is negligible (pH 3. 9-11) in dsRed. Time-resolved anisotropy of dsRed reveals rapid depolarization (211 +/- 6 ps) plus slow rotational motion (53 +/- 8 ns), in contrast with a single rotational time (16 +/- 2 ns) for Citrine. The molecular dimensions, calculated from rotational and translational diffusion, indicate that dsRed is hydrodynamically 3.8 +/- 0.4 times larger than predicted for a monomer, which suggests an oligomer (possibly a tetramer) configuration even at approximately 10(-9) M. The fast depolarization is attributed to intraoligomer energy transfer between mobile nonparallel chromophores with the initial anisotropy implying a 24 +/- 3 degrees depolarization angle. Large two-photon excitation cross sections ( approximately 100 GM at 990 nm for dsRed and approximately 50 GM at 970 nm for Citrine), advantageous for two-photon-fluorescence imaging in cells, are measured.