エリスロポエチン受容体へのヘテロミリックGIタンパク質の結合

エリスロポエチン（EPO）シグナル伝達に関与する新しいタンパク質を特定するために、EPO刺激UT7細胞からの抗ホスホチロシン抗体と反応性のタンパク質のセット全体を精製しました。これらのタンパク質に対して生成された抗血清を使用して、Lambdaexlox発現ライブラリをスクリーニングしました。分離されたcDNAの1つは、ヘテロシマーなGTP結合タンパク質のベータ2サブユニットであるGBETA2をコードします。GBETAおよびGALPHA（I）は、ヒトおよびマウス細胞株および正常な赤血球前駆細胞からの抽出物でEPO受容体（EPOR）とともに共沈しました。さらに、EPORの細胞内ドメインを含む融合タンパク質に関連するin vitro GBETA。EPOR変異体を使用して、GI結合にはEPORの遠位部分（アミノ酸459-479の間）が必要であることがわかりました。これらの細胞のEPO活性化により、EPORからGIタンパク質の放出が誘発されました。さらに、単離された細胞膜では、EPO治療はGIのADPリボシル化を阻害し、GTPの結合を増加させました。我々の結果は、ヘテロサイマーのGIタンパク質がEPORのC末端端に関連していることを示しています。受容体の活性化は、受容体からのGIの活性化と解離につながり、EPOシグナル伝達におけるGIタンパク質の機能的役割を示唆しています。

To identify new proteins involved in erythropoietin (Epo) signal transduction, we purified the entire set of proteins reactive with anti-phosphotyrosine antibodies from Epo-stimulated UT7 cells. Antisera generated against these proteins were used to screen a lambdaEXlox expression library. One of the isolated cDNAs encodes Gbeta2, the beta2 subunit of heterotrimeric GTP-binding proteins. Gbeta and Galpha(i) coprecipitated with the Epo receptor (EpoR) in extracts from human and murine cell lines and from normal human erythroid progenitor cells. In addition, in vitro Gbeta associated with a fusion protein containing the intracellular domain of the EpoR. Using EpoR mutants, we found that the distal part of the EpoR (between amino acids 459-479) was required for Gi binding. Epo activation of these cells induced the release of the Gi protein from the EpoR. Moreover in isolated cell membranes, Epo treatment inhibited ADP-ribosylation of Gi and increased the binding of GTP. Our results show that heterotrimeric Gi proteins associate with the C-terminal end of the EpoR. Receptor activation leads to the activation and dissociation of Gi from the receptor, suggesting a functional role of Gi protein in Epo signal transduction.