セロトニン5-HT（1D）受容体での構成活性：相同gtpgammasと[（35）] -gtpgammas結合等温線による検出

多くのGタンパク質共役受容体（GPCR）は構成的活性を示す可能性がありますが、その検出はこれまで、逆アゴニストの使用に依存していました。本研究は、中国のハムスター卵巣（CHO）細胞で安定して発現した組換えヒト（H）セロトニン（5-HT）5-HT（1D）受容体での構成活性を調査するための新しい手順を利用しました。5-HTは、グアノシン-5'-O-（3- [（35）] Thio） - 三リン酸（[（35）] s] -gtpgammas）cho-h5-ht（1d）膜に結合しますが、メチオテピンとメチオテピンと5-HT（1B/1D） - 選択リガンド、SB224,289は、基底[（35）] -GTPGAMMAS結合（逆アゴニズム）の堅牢な阻害を及ぼしました。これらのアクションは、小説、選択的な5-HT（1B/1D）リガンド、S18127によって逆転したため、特異的でした。構成的活性は、cho-h5-ht（1d）膜への[（35）] -GTPGAMMAS結合の相同阻害によって調査されました。「基礎」条件（受容体リガンドの欠如）では、二相等温線が観察されました。ほとんど（80％）[（35）s] -gtpgammas結合部位は、等温線の親和性（ha）と低親和性（la）成分に高い（ha）にありました。HA結合は、5-HT（155％、基底値= 100％に比べて155％まで）に増加しましたが、メチオテピン（23％に）およびSB224,289（67％）によって減少しました。対照的に、LAの結合は変更されませんでした。さらに、トランスフェクトされていないCHO細胞の膜はLA結合部位のみを示し、後者はH5-HT（1D）受容体Gタンパク質の結合に関連していないことを示しています。したがって、このCHO細胞株で発現した5-HT（1D）受容体では、基底条件下での相同阻害実験（GTPGAMMAS対[（35）] -GTPGAMMAS）で検出されたHA結合では、構成的Gタンパク質活性化の尺度を提供します。したがって、H5-HT（1D）受容体およびおそらく他のGPCRの場合、HA成分が基底条件下で存在する場合、[（35）] -GTPGAMMAS結合によって逆アゴニストが検出可能であることが示唆されています。

Although many G-protein-coupled receptors (GPCRs) may display constitutive activity, their detection has, to date, depended on the use of inverse agonists. The present study exploited a novel procedure to investigate constitutive activity at recombinant human (h) serotonin (5-HT) 5-HT(1D) receptors stably expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. 5-HT modestly stimulated guanosine-5'-O-(3-[(35)S]thio)-triphosphate ([(35)S]-GTPgammaS) binding to CHO-h5-HT(1D) membranes whereas methiothepin and the 5-HT(1B/1D)-selective ligand, SB224,289, exerted robust inhibition of basal [(35)S]-GTPgammaS binding (inverse agonism). These actions were specific inasmuch as they were reversed by the novel, selective 5-HT(1B/1D) ligand, S18127. Constitutive activity was investigated by homologous inhibition of [(35)S]-GTPgammaS binding to CHO-h5-HT(1D) membranes with unlabelled GTPgammaS. Under 'basal' conditions (absence of receptor ligand), biphasic isotherms were observed. Most (80%) [(35)S]-GTPgammaS binding sites were in the high affinity (HA) versus low affinity (LA) component of the isotherms. HA binding was augmented by 5-HT (to 155%; relative to basal values=100%), but decreased by methiothepin (to 23%) and by SB224,289 (to 67%). In contrast, LA binding was not altered. Further, membranes of untransfected CHO cells exhibited only LA binding sites, indicating that the latter are not related to h5-HT(1D) receptor-G-protein coupling. Thus, at 5-HT(1D) receptors expressed in this CHO cell line, HA binding detected in homologous inhibition experiments (GTPgammaS versus [(35)S]-GTPgammaS) under basal conditions provides a measure of constitutive G-protein activation. Thus, it is suggested that for h5-HT(1D) receptors and, possibly, other GPCRs, inverse agonists will be detectable by [(35)S]-GTPgammaS binding if a HA component is present under basal conditions.