ハウスキーピング遺伝子発現に対する実験的治療の効果：リアルタイム、定量的RT-PCRによる検証

一般的に使用される4つのハウスキーピング遺伝子の発現に対する血清の効果は、定量的RT-PCRアッセイの内部コントロール遺伝子を検証するために、血清刺激線維芽細胞で調べました。誘導性キメラ遺伝子をトランスフェクトしたNIH 3T3線維芽細胞を24時間血清浸漬した後、15％血清で8時間誘導しました。血清は細胞で発現した総RNAの量を変化させませんでしたが、mRNAの量は血清刺激とともに経時的に大幅に増加しました。それぞれの時点からのメッセンジャーと総RNAは、2つの異なる条件下で逆転写されました。反応が等量のRNAとRNA含有量に正規化されていない別の一連の反応を含むように正規化されたもの。得られたcDNAは、ベータ - アクチン、ベータ-2ミクロブリン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）および18SリボソマルRNAの遺伝子特異的プライマーを使用したリアルタイムの定量的PCRによって増幅されました。逆転写のすべての条件下で、ベータアクチンとGAPDHの発現は、それぞれ9倍と3倍まで増加しました（P <0.01）。18S rRNAの発現は、非正規化された総RNAから合成されたcDNAがアッセイされた場合に血清刺激とともに増加しました（p <0。01）が、逆転写がRNA含有量に正規化された場合（p> 0.05）。ベータ-2ミクロブリンの発現は、非正規化mRNAから合成されたcDNAからアッセイされると2倍まで増加しましたが、逆転写がmRNAに正規化された場合、血清の影響を受けませんでした。ベータ-2ミクロブリン発現は、非正規化された逆転写反応に存在するmRNAの量に直接比例することがわかった。したがって、ベータ-2ミクロブリンと18S rRNAは、定量的血清刺激研究における適切な内部コントロール遺伝子ですが、ベータ - アクチンとGAPDHはそうではありません。定量的遺伝子発現研究を設計する際には、内部コントロール遺伝子を適切に検証する必要があります。

The effects of serum on the expression of four commonly used housekeeping genes were examined in serum-stimulated fibroblasts in order to validate the internal control genes for a quantitative RT-PCR assay. NIH 3T3 fibroblasts transfected with an inducible chimeric gene were serum-starved for 24 h and then induced with 15% serum for 8 h. Serum did not alter the amount of total RNA that was expressed in the cells, however, the amount of mRNA significantly increased over time with serum-stimulation. Both messenger and total RNA from each of the time points were reverse transcribed under two different conditions; one in which the reactions were normalized to contain equal amounts of RNA and another series of reactions that were not normalized to RNA content. The resulting cDNA was amplified by real-time, quantitative PCR using gene-specific primers for beta-actin, beta-2 microglobulin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and 18S ribosomal RNA. The expression of beta-actin and GAPDH increased up to nine- and three-fold, respectively, under all conditions of reverse transcription (P<0.01). The expression of 18S rRNA increased with serum-stimulation when the cDNA synthesized from non-normalized, total RNA was assayed (P<0. 01) but not when the reverse transcriptions were normalized to RNA content (P>0.05). The expression of beta-2 microglobulin increased up to two-fold when assayed from cDNA synthesized from non-normalized mRNA, but was unaffected by serum when the reverse transcriptions were normalized to mRNA. beta-2 Microglobulin expression was found to be directly proportional to the amount of mRNA that was present in non-normalized reverse transcription reactions. Thus, beta-2 microglobulin and 18S rRNA are suitable internal control genes in quantitative serum-stimulation studies, while beta-actin and GAPDH are not. The internal control gene needs to be properly validated when designing quantitative gene expression studies.