サイトメガロウイルスに関連するチキンベータアクチンプロモーターを使用したラット肝臓での強い、長期導入遺伝子発現即時エンハンサー（CAGプロモーター）

肝臓の酵素欠乏における遺伝子治療を成功させるには、肝臓で長期的に強力な転写活性を維持できるプロモーターを使用することが不可欠です。CAGプロモーターの長期転写機能（チキンベータアクチンプロモーターとサイトメガロウイルスの即時エンハンサーの組み合わせ）の長期転写機能であるI型タイプIのモデル動物であるGunnラットを使用して、ラット肝臓で評価されました。CAGプロモーターとホスホグリセル酸マウスキナーゼプロモーターの制御下で、ヒトビリルビンUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（BUGT）およびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼの発現カセットを含むプラスミドPCAGGHUGTを構築しました。変異体SV40大抗原（（TS））を使用して確立された条件付き不死化ガンラット肝細胞（IGRH）に、PCAG-GHUGTをトランスフェクトしました。高レベルのbugtを発現する安定してトランスフェクトされたクローンigrhugtが、ヒグロマイシンを選択した後に得られました。33度Cで、細胞は約72時間で数が2倍になりました。ただし、37度Cでは、細胞の増殖が停止し、このクローンで温度依存性増殖の特性が保持されたことを示しています。1,000万個の細胞が、10日間隔で5回5回の合成ガンラットの脾臓に注入されました。血清ビリルビンレベルは、最初の移植後70日で45〜50％減少し、研究期間中（120日）その後そのまま続きました。これらの結果は、CAGプロモーターが少なくとも120日間、ラット肝臓で強力な転写活性を維持できることを示唆しています。

For successful gene therapy in hepatic enzyme deficiencies, it is essential to use promoters that can maintain strong transcriptional activity for the long term in the liver. Using Gunn rats, a model animal for Crigler-Najjar syndrome type I, the long-term transcriptional function of the CAG promoter (a combination of chicken beta-actin promoter and cytomegalovirus immediate-early enhancer) was evaluated in the rat liver. We constructed a plasmid pCAGGHUGT, containing expression cassettes of human bilirubin UDP-glucuronosyltransferase (BUGT) and hygromycin phosphotransferase, under the control of the CAG promoter and murine phosphoglycerate kinase promoter, respectively. Conditionally immortalized Gunn rat hepatocytes (IGRH), which had been established using mutant SV40 large T antigen ((TS)T), were transfected with pCAG-GHUGT. A stably transfected clone IGRHUGT, expressing a high level of BUGT, was obtained after selection with hygromycin. At 33 degrees C, the cells doubled in number in approximately 72 h; however, at 37 degrees C, cell proliferation stopped, indicating that the characteristic of temperature-dependent proliferation was retained in this clone. Ten million cells were injected into the spleen of syngeneic Gunn rats five times at 10-day intervals. Serum bilirubin levels were reduced by 45-50% at 70 days after the first transplantation and remained so throughout the duration of the study (120 days). These results suggested that the CAG promoter was able to maintain strong transcriptional activity in rat liver for at least 120 days.