フローサイトメトリーと光学顕微鏡分析による種牡馬の精子生存率の評価

精子の生存率は多数の方法で評価できますが、多くは遅くて繰り返し不十分であり、射精あたり100〜200の精子のみを評価します。4つの種牡馬のそれぞれから2つの射精を収集し、非脂肪乾燥ミルクソリッドグルコースエクステンダー（EZ Mixin）で50x10（6）の精子/mlに拡張しました。射精の半分は、液体窒素に10分間浸すことにより凍結しました。適切なボリュームのライブおよびフリーズで覆われた精子を使用したアリコートは、次のライブの比率を提供しました：死んだ精子：100：0、75：25、50：50、25：75、0：100。1）運動性により、各アリコートの生存率を決定しました。2）エオシン - ニグロシン染色;3）二重蛍光染色。後者の場合、SYBR-14およびヨウ化プロピジウムとインキュベートしたアリコートには、蛍光顕微鏡（2 x 100精子/サンプル）とフローサイトメトリー（10,000精子/サンプル）によって定量化された生および死んだ精子がありました。Live：Dead Stermatozoaの比率と、精子の割合と精子の割合との間に線形関係があることがわかりました（P <0.0001）。新鮮な精子の場合、既知のライブ：デッド比の相関係数はすべての方法で高かった（エオシン - ニグリン、r> 0.75;蛍光顕微鏡、r> 0.76;フローサイトメトリー、r> 0.75;運動性、r> 0.76）。凍結保存された馬の精子の生存率を決定するために、グリシンエクステンダーの6つの種牡馬から17匹の新鮮な射精を凍結しました。各サンプルを解凍し、EZミクシンで1：1を拡張し、上記のように評価しました。フローサイトメトリーによって評価された凍結保存された精子ゾアは、他の方法とはあまり相関していない傾向があり（r <0.68）、エオシン - ニグリン染色（p <0.001）で推定値が有意に高かった。この研究は、異なる方法が新鮮な馬の精子の生存率を等しく推定する可能性があることを示しています。ただし、フローサイトメトリーによる評価は、凍結保存された精子ではそれほど正確ではないようです。

Viability of spermatozoa can be assessed by numerous methods, but many are slow and poorly repeatable, and subjectively assess only 100 to 200 spermatozoa per ejaculate. We collected two ejaculates from each of 4 stallions, and extended them to 50x10(6) sperm/mL in a nonfat dried milk solids glucose extender (EZ Mixin). Half the ejaculate was freeze-killed by immersing in liquid nitrogen for 10 min. Aliquots using appropriate volumes of live and freeze-killed spermatozoa provided the following ratios of live:dead spermatozoa: 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100. We determined the viability of each aliquot by 1) motility; 2) eosin-nigrosin staining; and 3) dual fluorescent staining. For the latter, aliquots incubated with SYBR-14 and propidium iodide had live and dead spermatozoa quantitated by fluorescent microscope (2 x 100 sperm/sample) and flow cytometry (10,000 sperm/sample). We found a linear relationship between the ratio of live:dead spermatozoa and the percentage of spermatozoa counted as live (P<0.0001). For fresh spermatozoa, correlation coefficients of the known live:dead ratio were high for all methods (eosin-nigrosin, r>0.75; fluorescent microscope, r>0.76; flow cytometry, r>0.75; motility, r>0.76). To determine viability of cryopreserved equine spermatozoa, we froze 17 fresh ejaculates from 6 stallions in a glycine extender. Each sample was thawed, extended 1:1 with EZ Mixin and evaluated as above. Cryopreserved spermatozoa assessed by flow cytometry tended to be less well correlated (r<0.68) with the other methods, and estimates were significantly higher with eosin-nigrosin staining (P<0.001). This study shows that different methods may equally estimate viability of fresh equine spermatozoa. However, evaluation by flow cytometry appears to be less precise with cryopreserved spermatozoa.