2-ヒドロキシアミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-B]ピリジン細胞毒性およびグルタチオンS-トランスフェラーゼP1によるヒト前立腺のDNA付加物形成に対する保護

前立腺は、2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-B]ピリジン（PHIP）誘発発癌の標的として同定されています。人間は、十分に調理された肉の摂取を通じてPHIPにさらされ、前立腺発がんに赤身の肉の消費を含む疫学研究からの証拠があります。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）のアルファおよびPIクラスのアイソフォームは、無細胞系のDNAへの活性化PHIP代謝産物の内転を阻害することが示されています。ヒトでは、CPG島の高メチル化によるGST PI（GSTP1）のサイレンシングは、ほぼすべての前立腺癌で見られ、前立腺発がんの早期イベントであると考えられています。前立腺細胞におけるGSTP1発現を抑制したことが、活性化されたPHIP代謝産物によって媒介される細胞毒性とDNA付加物形成に対する脆弱性を高めると仮定しました。この仮説をテストするために、沈黙したGSTP1遺伝子を含むヒト前立腺腺癌細胞株LNCAPは、高レベルのGSTP1を構成的に発現するように遺伝的に修飾されました。24時間ではなく、n-OH-phipに曝露したLNCAPおよびLNCAP-GSTP1細胞の両方が、細胞生存率の用量依存性の減少を示しました。GSTP1過剰発現細胞は、ベクターのみをトランスフェクトした細胞よりも30〜40％高いLC50を有していました。n-OH-phipHIPHにさらされたLNCAP由来細胞および一次ヒト前立腺組織培養から単離されたPHIP-DNA付加物は、液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析により分析されました。ヒト前立腺組織およびLNCAP-GSTP1細胞の一次培養では、親のLNCAPおよびベクターコントロール細胞よりも約50％低い付加体レベルがありました。LNCAPサイトゾルを使用した生物活性化アッセイは、DNA結合種へのN-OH-PHIPの酵素活性化がATPに依存し、グルタチオンの存在下で組換えヒトGSTP1によって阻害されることを示しました。この証拠は、n-OH-phiphがヒト前立腺およびヒト前立腺由来細胞のDNA結合種に生物活性化される可能性があることを確認しています。これらの観察結果は、LNCAPおよびLNCAP-GSTP1細胞を、前立腺発癌におけるN-OH-PHIPHIPHが誘導したDNA損傷に対する保護におけるこの酵素の役割を研究するためのモデルシステムとして使用するための基礎を提供します。したがって、ヒト前立腺におけるGSTP1発現の喪失は、n-OH-phiphipheなどの化合物による発がん性in辱に対する感受性を高める可能性があります。逆に、初期段階の前立腺発がんにおけるGSTの誘導は、有用な保護戦略である可能性があります。

The prostate has been identified as a target for 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced carcinogenesis. Humans are exposed to PhIP through ingestion of well-done cooked meats, and there is evidence from epidemiological studies that implicates red meat consumption in prostate carcinogenesis. The alpha and pi class isoforms of glutathione S-transferases (GSTs) have been shown to inhibit adduction of activated PhIP metabolites to DNA in cell-free systems. In humans, silencing of GST pi(GSTP1) through CpG island hypermethylation is found in nearly all prostate carcinomas and is believed to be an early event in prostate carcinogenesis. We hypothesized that suppressed GSTP1 expression in prostate cells would increase their vulnerability to cytotoxicity and DNA adduct formation mediated by activated PhIP metabolites. To test this hypothesis, the human prostate adenocarcinoma cell line, LNCaP, which contains a silenced GSTP1 gene, was genetically modified to constitutively express high levels of GSTP1. Both LNCaP and LNCaP-GSTP1 cells exposed to N-OH-PhIP, but not parent PhIP, for 24 h showed a dose-dependent decrease in cell viability. GSTP1-overexpressing cells had LC50s 30-40% higher than cells transfected with the vector alone. PhIP-DNA adducts isolated from LNCaP-derived cells and primary human prostate tissue cultures exposed to N-OH-PhIP were analyzed by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Primary cultures of human prostate tissue and LNCaP-GSTP1 cells had approximately 50% lower adduct levels than parental LNCaP and vector control cells. Bioactivation assays using LNCaP cytosols showed that enzymatic activation of N-OH-PhIP to a DNA binding species was dependent on ATP and could be inhibited by recombinant human GSTP1 in the presence of glutathione. This evidence confirms that N-OH-PhIP can be bioactivated to a DNA binding species in human prostate and human prostate-derived cells. These observations provide the basis for using LNCaP and LNCaP-GSTP1 cells as a model system for studying the role of this enzyme in protection against N-OH-PhIP induced DNA damage in prostate carcinogenesis. Loss of GSTP1 expression in human prostate may, therefore, enhance its susceptibility to carcinogenic insult by compounds such as N-OH-PhIP. Conversely, induction of GSTs in early-stage prostate carcinogenesis may be a useful protective strategy.