RNA：退化したプライマーによってマルチゲンファミリーの既知のメンバーのPCR増幅を具体的に阻害する方法

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して特定のDNAを増幅する多用途の方法です。既知のすべての遺伝子ファミリーメンバーの間で高度に保存されているアミノ酸配列に基づいて縮退したPCRプライマーを設計することにより、マルチギーンファミリーの新しいメンバーを特定できます。このアプローチの固有の弱点は、新しい家族に加えて、退化したプライマーが以前に特定されたものを増幅することです。この問題に具体的に対処するために、既知の各ファミリーメンバーの特定のRNAを合成して、テンプレートの1つの鎖にハイブリダイズし、プライマーの3 '末端に隣接して、縮退したプライマーが結合しながらDNAポリメラーゼによる拡張を防止できるようにしました。。私たちの戦略をテストするために、私たちは、このファミリーを他のグアニル・シクラーゼから識別する、私たちのテンプレートおよび退化したプライマーとして、可溶性の一酸化窒素に敏感なグアニリル・シクラーゼ・ファミリーの既知のメンバーを使用しました。このファミリーの既知のメンバーの増幅は、対応するRNAによって単独または組み合わせで効果的かつ具体的に阻害されることを実証します。この堅牢な方法は、目的のPCR積がプライマー間で十分に異なる場合、複数のPCR産物が増幅される任意のアプリケーションに適合させることができます。

The polymerase chain reaction (PCR) is a versatile method to amplify specific DNA with oligonucleotide primers. By designing degenerate PCR primers based on amino acid sequences that are highly conserved among all known gene family members, new members of a multigene family can be identified. The inherent weakness of this approach is that the degenerate primers will amplify previously identified, in addition to new, family members. To specifically address this problem, we synthesized a specific RNA for each known family member so that it hybridized to one strand of the template, adjacent to the 3'-end of the primer, allowing the degenerate primer to bind yet preventing extension by DNA polymerase. To test our strategy, we used known members of the soluble, nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase family as our templates and degenerate primers that discriminate this family from other guanylyl cyclases. We demonstrate that amplification of known members of this family is effectively and specifically inhibited by the corresponding RNAs, alone or in combination. This robust method can be adapted to any application where multiple PCR products are amplified, as long as the sequence of the desired and the undesired PCR product(s) is sufficiently distinct between the primers.