熱酸化型スルホロブス酸性炭素からの最初の古細菌のアコニターゼの精製と特性評価

最初の古細菌のアコニターゼは、熱酸化型硫酸塩酸炭素のサイトゾルから分離されました。興味深いことに、酵素はイソクエン酸リアーゼと結合しました。この酵素は、アコニターゼ反応の反応産物であるイソキトレートを直接変換することも、これまでのクレナルチョタでは不明でした。両方のタンパク質は、Aconitaseで96 kDaの見かけの分子量を生成するSDSゲル電気泳動によってのみ分離でき、イソクソリン酸リアーゼでは46 kDaです。その高い酸素感受性にもかかわらず、アコニターゼは、直接アコニターゼアッセイシステムに基づいて、約55マイクロモールx min（-1）x mg（-1）の特定の活性に対して27倍濃縮される可能性があります。最大酵素活性はpH 7.4で測定され、古細菌酵素の最適な温度は75度Cで記録されました。80度Cで1時間のインキュベーション後、95度Cでさえ、約14分の半減期が決定され、熱安定性タンパク質として明確に定義されました。3つの基質の見かけのK（M）値は、Cis-Aconitate、クエン酸塩、およびアイソキテル酸塩の値を、それぞれ108 microM、2.9 mm、370 microMとして発見しました。アコニターゼ反応は、典型的な阻害剤フルオロシトレート、トランスアコン化、およびトリカルバリレートによって阻害されました。S. acidocaldarius aconitaseの3つの内部ペプチドのアミノ酸シーケンスにより、古細菌酵素に高度に保存された残基が存在することが明らかになりました。アミノ酸配列のアライメントにより、S。adis-colocaldariusの配列は、他の推定上の古細菌または既知の真核および細菌配列のいずれかと非常に相同性があることがわかりました。EPR-Spectroscopyで示されているように、酵素は相互変換可能な[3FE-4S]クラスターをホストします。

The first archaeal aconitase was isolated from the cytosol of the thermoacidophilic Sulfolobus acidocaldarius. Interestingly, the enzyme was copurified with an isocitrate lyase. This enzyme, directly converting isocitrate, the reaction product of the aconitase reaction, was also unknown in crenarchaeota, thus far. Both proteins could only be separated by SDS gel electrophoresis yielding apparent molecular masses of 96 kDa for the aconitase and 46 kDa for the isocitrate lyase. Despite of its high oxygen sensitivity, the aconitase could be enriched 27-fold to a specific activity of approximately 55 micromol x min(-1) x mg(-1), based on the direct aconitase assay system. Maximal enzyme activities were measured at pH 7.4 and the temperature optimum for the archaeal enzyme was recorded at 75 degrees C, slightly under the growth optimum of S. acidocaldarius around 80 degrees C. Thermal inactivation studies of the aconitase revealed the enzymatic activity to be uninfluenced after one hour incubation at 80 degrees C. Even at 95 degrees C, a half-life of approximately 14 min was determined, clearly defining it as a thermostable protein. The apparent K(m) values for the three substrates cis-aconitate, citrate and isocitrate were found as 108 microM, 2.9 mM and 370 microM, respectively. The aconitase reaction was inhibited by the typical inhibitors fluorocitrate, trans-aconitate and tricarballylate. Amino-acid sequencing of three internal peptides of the S. acidocaldarius aconitase revealed the presence of highly conserved residues in the archaeal enzyme. By amino-acid sequence alignments, the S. acidocaldarius sequence was found to be highly homologous to either other putative archaeal or known eukaryal and bacterial sequences. As shown by EPR-spectroscopy, the enzyme hosts an interconvertible [3Fe--4S] cluster.