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プラスミドR64 PILQ遺伝子は、IV型層である薄い毛皮の形成に不可欠です。PILQ製品にはNTP結合モチーフが含まれており、NTPaseのPule-Virb11ファミリーに属します。PILQ遺伝子はN末端のHISタグで過剰発現し、Pilqタンパク質が精製されました。精製された彼のタグPilqタンパク質は、pH 6.5で0.71 nmol/min/mgのv（max）、k（m）0.26 mmでAtPase活性を示しました。ゲルろ過クロマトグラフィーにより、Pilqタンパク質は460 kDaに対応する位置で溶出し、PILQタンパク質がホムクタマーを形成することを示唆しました。Pilqタンパク質の構造と機能の関係を分析するために、いくつかの保存されたモチーフ内でアミノ酸置換が導入されました。11のミスセンス変異体のうち、7つの変異体が液体マットでさまざまなレベルのDNA移動頻度を示しました。4つの変異遺伝子（T234I、K238Q、D263N、およびH328A）は、彼のタグで過剰発現しました。精製された変異体PILQタンパク質には、さまざまなレベルのATPase活性が含まれていました。3つの変異体PILQタンパク質は、野生型PILQと同様の安定したマルチマーを形成しましたが、PILQ D263Nマルチマーは不安定でした。PILQ D263Nモノマーは低ATPase活性を示しましたが、PILQ D263Nマルチマーはそうではありませんでした。これらの結果は、PILQマルチマーのATPase活性がR64薄いPilus生合成に不可欠であることを示しています。
プラスミドR64 PILQ遺伝子は、IV型層である薄い毛皮の形成に不可欠です。PILQ製品にはNTP結合モチーフが含まれており、NTPaseのPule-Virb11ファミリーに属します。PILQ遺伝子はN末端のHISタグで過剰発現し、Pilqタンパク質が精製されました。精製された彼のタグPilqタンパク質は、pH 6.5で0.71 nmol/min/mgのv（max）、k（m）0.26 mmでAtPase活性を示しました。ゲルろ過クロマトグラフィーにより、Pilqタンパク質は460 kDaに対応する位置で溶出し、PILQタンパク質がホムクタマーを形成することを示唆しました。Pilqタンパク質の構造と機能の関係を分析するために、いくつかの保存されたモチーフ内でアミノ酸置換が導入されました。11のミスセンス変異体のうち、7つの変異体が液体マットでさまざまなレベルのDNA移動頻度を示しました。4つの変異遺伝子（T234I、K238Q、D263N、およびH328A）は、彼のタグで過剰発現しました。精製された変異体PILQタンパク質には、さまざまなレベルのATPase活性が含まれていました。3つの変異体PILQタンパク質は、野生型PILQと同様の安定したマルチマーを形成しましたが、PILQ D263Nマルチマーは不安定でした。PILQ D263Nモノマーは低ATPase活性を示しましたが、PILQ D263Nマルチマーはそうではありませんでした。これらの結果は、PILQマルチマーのATPase活性がR64薄いPilus生合成に不可欠であることを示しています。
Plasmid R64 pilQ gene is essential for the formation of thin pilus, a type IV pilus. The pilQ product contains NTP binding motifs and belongs to the PulE-VirB11 family of NTPases. The pilQ gene was overexpressed with an N-terminal His tag, and PilQ protein was purified. Purified His tag PilQ protein displayed ATPase activity with a V(max) of 0.71 nmol/min/mg of protein and a K(m) of 0.26 mm at pH 6.5. By gel filtration chromatography, PilQ protein was eluted at the position corresponding to 460 kDa, suggesting that PilQ protein forms a homooctamer. To analyze the relationship between structure and function of PilQ protein, amino acid substitutions were introduced within several conserved motifs. Among 11 missense mutants, 7 mutants exhibited various levels of reduced DNA transfer frequencies in liquid matings. Four mutant genes (T234I, K238Q, D263N, and H328A) were overexpressed with a His tag. The purified mutant PilQ proteins contained various levels of reduced ATPase activity. Three mutant PilQ proteins formed stable multimers similar to wild-type PilQ, whereas the PilQ D263N multimer was unstable. PilQ D263N monomer exhibited low ATPase activity, while PilQ D263N multimer did not. These results indicate that ATPase activity of the PilQ multimer is essential for R64 thin pilus biogenesis.
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