核輸出の刺激と、RAN結合タンパク質への結合が不足しているRAN変異体による核輸入の阻害1

受容体を介した核細胞質輸送は、GTPase RANおよびRAN結合タンパク質1（RANBP1）に依存しています。RANの酸性C末端は、RANとRANBP1の間の高い親和性相互作用に必要です。アラニン（RANC4A）に修飾された5つの酸性C末端アミノ酸のうち4つを備えた新規のRAN変異体は、RANBP1に対する約20倍の親和性を減らしていることがわかりました。透過化されたHELA細胞における核の輸入と輸出に対するRANC4Aの影響を調査しました。RANC4Aは、細胞質ヌクレオポリンNUP214での核輸出受容体CRM1の蓄積を促進しますが、GFP-NFATの核輸出を強く刺激します。RANC4AはCRM1およびその他の核輸送受容体に対して親和性の上昇を示すため、これは、CRM1、RAN-GTP、および基質を含む輸出錯体の形成がNUP214からの放出ではなく、輸出の速度制限ステップであることを示唆しています。逆に、クラシックな核局在化シーケンスに結合されたウシ血清アルブミンのインポートアルファ/ベータ依存性核輸入は、RANC4Aによって強く阻害されます。阻害は、インポーチンアルファ/ベータ錯体の形成を促進する追加のインポートアルファによって逆転することができます。これらの結果は、RANBP1およびインポートアルファによるインポートベータからのran-gtpの放出が、輸送能力状態へのインポートベータのリサイクルにとって重要であるという生理学的証拠を提供します。

Receptor-mediated nucleocytoplasmic transport is dependent on the GTPase Ran and Ran-binding protein 1 (RanBP1). The acidic C terminus of Ran is required for high affinity interaction between Ran and RanBP1. We found that a novel Ran mutant with four of its five acidic C-terminal amino acids modified to alanine (RanC4A) has an approximately 20-fold reduced affinity for RanBP1. We investigated the effects of RanC4A on nuclear import and export in permeabilized HeLa cells. Although RanC4A promotes accumulation of the nuclear export receptor CRM1 at the cytoplasmic nucleoporin Nup214, it strongly stimulates nuclear export of GFP-NFAT. Since RanC4A exhibits an elevated affinity for CRM1 and other nuclear transport receptors, this suggests that formation of the export complex containing CRM1, Ran-GTP, and substrate is a rate-limiting step in export, not release from Nup214. Conversely, importin alpha/beta-dependent nuclear import of bovine serum albumin, coupled to a classical nuclear localization sequence is strongly inhibited by RanC4A. Inhibition can be reversed by additional importin alpha, which promotes the formation of an importin alpha/beta complex. These results provide physiological evidence that release of Ran-GTP from importin beta by RanBP1 and importin alpha is critical for the recycling of importin beta to a transport-competent state.