リボヌクレアーゼAから核酸結合の活性部位ヒスチジン残基の寄与

His12とHis119は、リボヌクレアーゼA（RNase A）によるRNA切断の触媒に重要です。いずれかの残基とアラニンの置換により、K（CAT）/K（M）の値が10（4）を超える値を減少させます。His12とHis119は、酵素層状複合体のRNA基質の硬化性ホスホリル基に近位です。ここでは、RNA結合におけるこれらの活性部位ヒスチジンの役割は、酵素核酸複合体の安定性に対する変異誘発とpHの効果を監視することにより調査されました。それぞれ1.7および1.8 Aの解像度でのH12AおよびH119AバリアントのX線回折分析は、アミノ酸置換がバリアントの全体的な構造を混乱させないことを示しています。野生型RNase AとpH 6.0での3'-umpを含むバリアントの錯体化に関する等温滴定熱量測定研究は、His12とHis119がそれぞれ1.4および1.1 kcal/molが複雑な安定性に寄与していることを示しています。野生型RNase Aおよび6-カルボキシフルオレセインの錯体の安定性の測定蛍光異方性により、PHが変化するPHSでの約D（AUAA）は、pHが8.0から4.0に減少すると安定性が2.4 kcal/molが増加することを示しています。pH 4.0では、His12をアラニン残基に置き換えると、錯体の安定性が6-カルボキシフルオレセインと約2.3 kcal/molの安定性を低下させます。一緒に、これらの構造および熱力学的データは、核酸結合へのヒスチジン残基の寄与の最初の徹底的な分析を提供します。

His12 and His119 are critical for catalysis of RNA cleavage by ribonuclease A (RNase A). Substitution of either residue with an alanine decreases the value of k(cat)/K(M) by more than 10(4)-fold. His12 and His119 are proximal to the scissile phosphoryl group of an RNA substrate in enzyme-substrate complexes. Here, the role of these active site histidines in RNA binding was investigated by monitoring the effect of mutagenesis and pH on the stability of enzyme-nucleic acid complexes. X-ray diffraction analysis of the H12A and H119A variants at a resolution of 1.7 and 1.8 A, respectively, shows that the amino acid substitutions do not perturb the overall structure of the variants. Isothermal titration calorimetric studies on the complexation of wild-type RNase A and the variants with 3'-UMP at pH 6.0 show that His12 and His119 contribute 1.4 and 1.1 kcal/mol to complex stability, respectively. Determination of the stability of the complex of wild-type RNase A and 6-carboxyfluorescein approximately d(AUAA) at varying pHs by fluorescence anisotropy shows that the stability increases by 2.4 kcal/mol as the pH decreases from 8.0 to 4.0. At pH 4.0, replacing His12 with an alanine residue decreases the stability of the complex with 6-carboxyfluorescein approximately d(AUAA) by 2.3 kcal/mol. Together, these structural and thermodynamic data provide the first thorough analysis of the contribution of histidine residues to nucleic acid binding.