GLUの切断のメカニズムとしての酸性加水分解（298） - >ヒト内皮一酸化窒素シンターゼのASPバリアント

残基298で、それぞれグルタミン酸またはアスパラギン酸のヒト内皮一酸化窒素シンターゼ（ENOS）遺伝子コードのエクソン7内の894g - > t多型は、心血管起源のいくつかの疾患に関連しています。最近の報告では、ASP（298） - エノ（E298D）が100および35 kDaの断片に対して細胞内に切断されており、内皮機能の低下のメカニズムを示唆しています。ここでは、E298Dバリアントの正確な切断部位を、野生型ENOS（Glu（298））では見られないユニークなアスパルティルプロリル（298） - プロ（299））結合として記録しました。細胞およびin vitroで分離されたE298D-ENOは、酸性加水分解の影響を受けやすく、低pHで温度を上げることにより100 kDaフラグメントを生成できることを示しています。重要なことに、E298Dの切断は、ASP-Pro結合の酸性加水分解を制限するように設計されたサンプルバッファーシステムを使用して排除されました。これらの結果は、E298D-ENOの細胞内処理に反対しており、以前に記載されたE298Dの断片化がサンプル調製の産物である可能性があることを示唆しています。また、ENOSの離職、産生がない、および細胞ストレスに対する感受性は、WT対E298D-ENOを発現する細胞で異なっていないことがわかりました。最後に、酵素活性はそれぞれの組換え酵素で同一でした。したがって、細胞内切断メカニズムは、エクソン7の多型と心血管疾患との関連を説明する可能性は低い。

The 894G-->T polymorphism within exon 7 of the human endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) gene codes for glutamate or aspartate, respectively, at residue 298 and has been associated with several diseases of cardiovascular origin. A recent report indicates that Asp(298)-eNOS (E298D) is cleaved intracellularly to 100- and 35-kDa fragments, suggesting a mechanism for reduced endothelial function. Here we have documented the precise cleavage site of the E298D variant as a unique aspartyl-prolyl (Asp(298)--Pro(299)) bond not seen in wild-type eNOS (Glu(298)). We show that E298D-eNOS, as isolated from cells and in vitro, is susceptible to acidic hydrolysis, and the 100-kDa fragment can be generated ex vivo by increasing temperature at low pH. Importantly, cleavage of E298D was eliminated using a sample buffer system designed to limit acidic hydrolysis of Asp--Pro bonds. These results argue against intracellular processing of E298D-eNOS and suggest that previously described fragmentation of E298D could be a product of sample preparation. We also found that eNOS turnover, NO production, and the susceptibility to cellular stress were not different in cells expressing WT versus E298D-eNOS. Finally, enzyme activities were identical for the respective recombinant enzymes. Thus, intracellular cleavage mechanisms are unlikely to account for associations between the exon 7 polymorphism and cardiovascular diseases.