アスコルビン酸ペルオキシダーゼと過酸化水素の反応におけるトリプトファンラジカルの検出

H2O2に対する組換えPEAサイトゾルアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（RAPX）の反応性は、HPLCと一緒にUV/可視およびEPR分光法を使用して中間体の性質と反応の産物を調べています。RapxのH2O2に相当する1モルとの反応によって生成されたRapxの化合物Iには、ポルフィリンPi-cation Radicalが含まれています。この種は不安定であり、還元基質の存在下では、60秒以内から2番目の種、化合物I*、UV/可視スペクトル[Lambda（max）（nm）= 414、527、558および350（sh）]西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ化合物IIとシトクロムCペルオキシダーゼ化合物の両方のものと同一ではない。アスコルビン酸1モル相当の存在下で1モル相当のH2O2を持つRAPX [Lambda（Max）（NM）= 416、527、554、350（SH）および628（SH）]。化合物I*は、一次RAPX（ラムダ（MAX）= 403 nm）と分光的に同一ではない「鉄のような」種（ラムダ（MAX）= 406 nm）を与えるために減衰します。'=（2.7 +/- 0.3）x 10（-4）s（-1）。化合物IIの本物のサンプルは、第二鉄Rapx [k（崩壊）=（1.1 +/- 0.2）x 10（-3）s（-1）]に進化します。低温（10 k）EPRスペクトルは、タンパク質ベースのラジカルの形成と一致しており、化合物I*（g平行= 2.038、g垂直= 2.008）のg値は、シトクロムCのTRP191ラジカルについて以前に報告されたものに近いものに近いペルオキシダーゼ（g平行= 2.037、g垂直= 2.005）。RAPX化合物IIのEPRスペクトルは、G = 2領域で本質的に静かでした。「鉄のような」RAPXのトリプティック消化とそれに続くRP-HPLCは、330 nmの近くに新しい吸収ピークがあるフラグメントを明らかにし、ヒドロキシル化トリプトファン残基の形成と一致しました。結果は、RAPXが特定の条件下で、シトクロムCペルオキシダーゼに見られるものと同様のタンパク質ベースのラジカルを形成できることを初めて示しています。これらのデータの意味は、HaemペルオキシダーゼのAPX触媒とラジカル形成と安定性の両方のより広いコンテキストで説明されています。

The reactivity of recombinant pea cytosolic ascorbate peroxidase (rAPX) towards H2O2, the nature of the intermediates and the products of the reaction have been examined using UV/visible and EPR spectroscopies together with HPLC. Compound I of rAPX, generated by reaction of rAPX with 1 molar equivalent of H2O2, contains a porphyrin pi-cation radical. This species is unstable and, in the absence of reducing substrate, decays within 60 s to a second species, compound I*, that has a UV/visible spectrum [lambda(max) (nm) = 414, 527, 558 and 350 (sh)] similar, but not identical, to those of both horseradish peroxidase compound II and cytochrome c peroxidase compound I. Small but systematic differences were observed in the UV/visible spectra of compound I* and authentic rAPX compound II, generated by reaction of rAPX with 1 molar equivalent H2O2 in the presence of 1 molar equivalent of ascorbate [lambda(max) (nm) = 416, 527, 554, 350 (sh) and 628 (sh)]. Compound I* decays to give a 'ferric-like' species (lambda(max) = 406 nm) that is not spectroscopically identical to ferric rAPX (lambda(max) = 403 nm) with a first order rate constant, k(decay)' = (2.7 +/- 0.3) x 10(-4) s(-1). Authentic samples of compound II evolve to ferric rAPX [k(decay) = (1.1 +/- 0.2) x 10(-3) s(-1)]. Low temperature (10 K) EPR spectra are consistent with the formation of a protein-based radical, with g values for compound I* (g parallel = 2.038, g perpendicular = 2.008) close to those previously reported for the Trp191 radical in cytochrome c peroxidase (g parallel = 2.037, g perpendicular = 2.005). The EPR spectrum of rAPX compound II was essentially silent in the g = 2 region. Tryptic digestion of the 'ferric-like' rAPX followed by RP-HPLC revealed a fragment with a new absorption peak near 330 nm, consistent with the formation of a hydroxylated tryptophan residue. The results show, for the first time, that rAPX can, under certain conditions, form a protein-based radical analogous to that found in cytochrome c peroxidase. The implications of these data are discussed in the wider context of both APX catalysis and radical formation and stability in haem peroxidases.