プロスタグランジンHシンターゼの2つのアイソフォームにおける機能上のカルボキシル末端セグメント構造の明確な影響

2つのプロスタグランジンHシンターゼ（PGHS）アイソフォーム、PGHS -1および-2のシクロオキシゲナーゼ活性は、プロスタノイド生合成の主要な制御要素です。2つのPGHSアイソフォームには60％のアミノ酸同一性があり、C末端の近くで顕著な違いがあり、PGHS-2には追加の18枚のレシドインサートがあります。PGHS-1および-2のC末端残基のいくつかの変異は、タンパク質の触媒活性および/または細胞内標的化を破壊することがわかっていますが、2つのアイソフォームのC末端構造と機能の関係はあまり定義されていません。結晶学的データは、PGHS-1および-2 C末端が小胞体（ER）膜と相互作用するように位置していることを示していますが、C末端セグメント構造はどちらのアイソフォームでも分解されませんでした。ヒトPGHS-1および-2の一連のC末端置換、欠失、および挿入変異体を構築し、組換えタンパク質を発現するトランスフェクトされたCOS-1細胞におけるシクロオキシゲナーゼ活性と細胞内標的に対する影響を評価しました。PGHS-1シクロオキシゲナーゼ活性は、C末端置換と削除によって強く破壊されましたが、最終的な残基が変化した場合でも、C末端セグメントの伸長によっては強く破壊されました。PGHS-2と同様の変化は、シクロオキシゲナーゼ活性に対する効果が著しく低かった。結果は、PGHS-2の長いC末端セグメントの機能が、より短いPGHS-1 C末端セグメントよりも構造変化に対して明らかに耐性があることを示しています。C末端置換または欠失は、トランスフェクション後の短い時間でさえ、いずれかのアイソフォームの細胞内局在を変更しませんでした。これは、どちらのC末端セグメントにも不可欠な細胞内標的信号が含まれていないことを示しています。

The cyclooxygenase activity of the two prostaglandin H synthase (PGHS) isoforms, PGHS-1 and -2, is a major control element in prostanoid biosynthesis. The two PGHS isoforms have 60% amino acid identity, with prominent differences near the C-terminus, where PGHS-2 has an additional 18-residue insert. Some mutations of the C-terminal residue in PGHS-1 and -2 have been found to disrupt catalytic activity and/or intracellular targeting of the proteins, but the relationship between C-terminal structure and function in the two isoforms has been poorly defined. Crystallographic data indicate the PGHS-1 and -2 C-termini are positioned to interact with the endoplasmic reticulum (ER) membrane, although the C-terminal segment structure was not resolved for either isoform. We constructed a series of C-terminal substitution, deletion, and insertion mutants of human PGHS-1 and -2 and evaluated the effects on cyclooxygenase activity and intracellular targeting in transfected COS-1 cells expressing the recombinant proteins. PGHS-1 cyclooxygenase activity was strongly disrupted by C-terminal substitutions and deletions, but not by elongation of the C-terminal segment, even when the ultimate residue was altered. Similar alterations to PGHS-2 had markedly less effect on cyclooxygenase activity. The results indicate that the functioning of the longer C-terminal segment in PGHS-2 is distinctly more tolerant of structural change than the shorter PGHS-1 C-terminal segment. C-Terminal substitutions or deletions did not change the subcellular localization of either isoform, even at short times after transfection, indicating that neither C-terminal segment contains indispensable intracellular targeting signals.