新規ペプチド - リガンドアルブミンを使用した疾患誘発薬物ターゲティング

非標識：残念ながら、サイトカインおよび成長因子受容体との相互作用のために設計された小さな治療オリゴペプチド（2〜12アミノ酸）は、体から急速に除去されます。効率的な糸球体ろ過とキャリアを介した膜輸送プロセスがそのクリアランスに関与しています。そのようなペプチドの高分子への結合により、これらの経路を介した除去が防止され、特定の受容体への曝露が大幅に改善される可能性があります。これらのコンストラクトのいくつかは、受容体を介したエンドサイトースを受け、キャリアとして使用して、関連する薬物を体内のさまざまな細胞タイプに届けることができます。新糖タンパク質のキャリアの場合、病気の状態で対象とした受容体のダウンレギュレーションが発生する可能性があることが示されています。したがって、私たちは、病理学的標的組織で高度に上方制御されることが知られている受容体に帰宅する新しいタイプのポリペプチド担体を設計しました。この目的のために、特に活性化された肝星細胞（HSC）で発現する受容体を対象としたPDGFおよびコラーゲン型VIの受容体を認識するドメインを表すリガンドペプチド（最小化タンパク質）を設計しました。細胞のこの筋線維芽細胞型は、肝臓線維症中の結合組織の拡大に大きく寄与しています。星細胞の薬物キャリアは以前に報告されていません。 方法：2つの受容体に対する親和性を備えた環状オクタペプチド部分（N10--12）をHSA（それぞれPPB-HSAおよびPCVI-HSA）に結合しました。受容体結合実験により、これらのリガンドペプチドのin vitroでの受容体への結合が確認されました。 in vitroの研究：ラットHSCは、標準的な技術に従って分離および精製されました。細胞を2日間（静止表現型）または10日間（活性化された表現型）培養しました。細胞培養物をキャリアと結合（4度Cで）でインキュベートし、取り込み（37度Cで）、放射性および免疫組織化学的方法で分解を決定しました。結果は、変更されていないHSAで得られたデータと比較されました。 生体内研究：PCVI-HSAおよびPPB-HSAの臓器分布は、i.v。胆管結紮の3週間後、正常および線維性ラットでのトレーサー用量の注入。肝細胞分布は、抗HSA IgGと組み合わせて、指定された肝細胞型に対する抗体を伴う肝切片の二重免疫染色の後に採点されました。 in vitro研究：3つのキャリアはすべて、静止したHSCではなく、活性化されたものに優先的に結合しています。細胞への結合は、過剰な非標識PCVI-HSAによって抑制され、エンドサイトーシスはタンパク質のリソソームルーティングを示唆する2 mMモネンシンによって阻害されましたが、少なくとも部分的にはPPB-HSAは細胞表面に残っていました。2時間の実験中に、線維性ラット肝臓スライスとのインキュベーション後、キャリアの分解生成物が細胞外で検出されました。 生体内研究：注射後10分で線維性肝臓に蓄積したPCVI-HSAの用量の62 +/- 6％。線維性ラット肝臓に蓄積されたPPB-HSAの48 +/- 9％が主にHSCによって取り上げられました（5）。同様の量の両方のコンストラクトが通常のラット肝臓で取り上げられましたが、主に他の細胞タイプでは取り上げられました。星細胞への優先的なホーミングは、線維性肝臓のみが、この細胞型の顕著な増殖と、病気の状態のこれらの細胞の標的受容体の過剰発現によって説明されます。 結論：in vivoの結果は、線維性ラット肝臓、特に星細胞におけるHSCにこれらの修飾されたアルブミンの蓄積を示すin vitro研究をサポートしています。結果は、星細胞の標的化の特異性を示し、細胞内作用する薬物のキャリアとしてのPCVI-HSAの適用性を暗示しています。さらに、PPB-HSAは、受容体拮抗薬などの細胞外作用に作用する薬物を供給するために使用される場合があります。この概念は、in vivoで十分に効果的ではない従来の薬物の提供のための新しい機会を生み出したり、深刻な肝外副作用を示したりする可能性があります。可溶性または粒子タイプの高分子に付着した最小化されたタンパク質は、標的にされる疾患プロセスによって選択的な身体分布が誘導される新しいキャリアモダリティを表しています。それらは受容体拮抗薬として利用することができ、同時に治療薬を望ましい作用部位に届けることができます（デュアルターゲティング）。

UNLABELLED: Small therapeutic oligopeptides (two to 12 amino acids), designed for interaction with cytokine and growth factor receptors, unfortunately, are rapidly removed from the body. Efficient glomerular filtration and carrier-mediated membrane transport processes are involved in their clearance. By coupling of such peptides to macromolecules, elimination via these pathways is prevented and exposure to the particular receptors can be largely improved. Some of these constructs undergo receptor-mediated endocytoses and can be used as carriers to deliver associated drugs to various cell types in the body. It has been shown that, in the case of neo-glycoprotein carriers, down-regulation of the receptors aimed at can occur in the diseased state. We therefore designed a new type of polypeptide carrier, homing on receptors that are known to be highly upregulated in the pathological target tissue. For this purpose we designed ligand peptides (minimized proteins) representing the receptor-recognizing domains of PDGF and collagen type VI, aimed at receptors that are highly expressed, particularly on activated hepatic stellate cells (HSC). This myofibroblast-type of cell largely contributes to connective tissue expansion during liver fibrosis. Drug carriers for the stellate cell have not been reported before. METHODS: Cyclic octapeptide moieties (n10--12) with affinity for the two receptors were coupled to HSA (pPB-HSA and pCVI-HSA, respectively). Receptor binding experiments confirmed binding of these ligand peptides to their receptors in vitro. IN VITRO STUDIES: rat HSC were isolated and purified according to standard techniques. The cells were cultured for 2 days (quiescent phenotype) or for 10 days (activated phenotype). Cell cultures were incubated with the carriers and the binding (at 4 degrees C), uptake (at 37 degrees C), and degradation were determined with radioactive and immunohistochemical methods. The results were compared with data obtained with unmodified HSA. IN VIVO STUDIES: the organ distribution of pCVI-HSA and pPB-HSA was determined 10 min after i.v. injection of tracer doses in normal and fibrotic rats, 3 weeks after bile duct ligation. Hepatocellular distribution was scored after double-immunostaining of the liver sections with an antibody against the designated hepatic cell type in combination with anti-HSA IgG. IN VITRO STUDIES: All three carriers preferentially bound to the activated rather than to quiescent HSC. Binding to cells was inhibitable by an excess of unlabelled pCVI-HSA, endocytosis was inhibitable by 2 mM monensin suggestive of lysosomal routing of the proteins, whereas pPB-HSA, at least partly, remained at the cell surface. Degradation products of the carriers were detected extracellularly after incubation with fibrotic rat liver slices during 2-h experiments. IN VIVO STUDIES: 62+/-6% of the dose of pCVI-HSA accumulated in fibrotic livers at 10 min after injection, of which the major part was taken up in HSC. 48+/-9% of pPB-HSA accumulated in fibrotic rat livers and this carrier was also mainly taken up by HSC (5). Similar amounts of both constructs were taken up in normal rat livers, but predominantly in other cell types. The preferential homing to the stellate cells, only in the fibrotic liver is explained by the marked proliferation of this cell type as well as overexpression of the targeted receptors on these cells in the diseased state. CONCLUSIONS: The in vivo results support the in vitro studies showing accumulation of these modified albumins in HSC in fibrotic rat livers and, in particular, in the stellate cells. The results demonstrate the specificity of the stellate cell targeting and imply applicability of pCVI-HSA as carriers for drugs that act intracellularly. In addition, pPB-HSA may be used to deliver drugs that act extracellularly, such as receptor antagonists. This concept may create new opportunities for delivery of conventional drugs that are not effective enough in vivo and/or display serious extrahepatic side-effects. Minimized proteins attached to soluble or particle type of macromolecules represent a novel carrier modality of which selective body distribution is induced by the disease process to be targeted. They can be utilized as receptor antagonists and at the same time can deliver therapeutic agents to the desired site of action (dual targeting).