3つの細菌種の複製開始のために異なる要件を持つ幅広い宿主範囲レプリコン

プラスミドRK2は、広範囲のグラム陰性菌で安定して複製する能力が珍しいです。RK2複製には、複製起点（ORIV）およびプラスミドエンコード開始タンパク質（TRFA、33および44 kDa型として表される）が不可欠です。大腸菌とは無関係の細菌の開始イベントを調べるために、プソイドモナス・プチダと緑膿菌の複製ヘリカーゼDnabをコードする遺伝子を分離し、タンパク質発現ベクターを構築するために使用されました。精製されたタンパク質は、RK2 ORIVでE.Coli DNABとともに活性についてテストされました。各ヘリカーゼは、宿主特異的DNAAタンパク質とTRFAタンパク質の存在下でRK2起源で動員され、活性化される可能性があります。Escherichia coliまたはP.putida dnabはTRFA-33またはTRFA-44のいずれかで活動していましたが、P.Aeruginosa DNABは活性化にTRFA-44を必要としました。さらに、E.coli DNabヘリカーゼとは異なり、ATPaseアクセサリータンパク質がない場合、両方のPseudomonasヘリカーゼをORIVで送達および活性化することができました。したがって、DNACのようなアクセサリーATPaseは、複製起点で必須の複製ヘリカーゼをロードするために普遍的に必要ではありません。

Plasmid RK2 is unusual in its ability to replicate stably in a wide range of Gram-negative bacteria. The replication origin (oriV) and a plasmid-encoded initiation protein (TrfA; expressed as 33 and 44 kDa forms) are essential for RK2 replication. To examine initiation events in bacteria unrelated to Escherichia coli, the genes encoding the replicative helicase, DnaB, of Pseudomonas putida and Pseudomonas aeruginosa were isolated and used to construct protein expression vectors. The purified proteins were tested for activity along with E.coli DnaB at RK2 oriV. Each helicase could be recruited and activated at the RK2 origin in the presence of the host-specific DnaA protein and the TrfA protein. Escherichia coli or P.putida DnaB was active with either TrfA-33 or TrfA-44, while P.aeruginosa DnaB required TrfA-44 for activation. Moreover, unlike the E.coli DnaB helicase, both Pseudomonas helicases could be delivered and activated at oriV in the absence of an ATPase accessory protein. Thus, a DnaC-like accessory ATPase is not universally required for loading the essential replicative helicase at a replication origin.