ギャップの監視リアルタイムで原子分解能でのH-Ras GTPase反応

RASによるGTPase活性化タンパク質（GAP）触媒GTP加水分解の分子反応メカニズムは、Caged GTP（P（3）-1-（2-Nitro）フェニルエチルグアノシニネインを使用した時間分解フーリエ変換赤外（FTIR）差分光法により調査されました。5'-o-triphosphate）Photolabileトリガーとして。このアプローチは、原子レベルでの時間分解能を持つ完全なGTPase反応経路を提供します。これまで、ギャップx ras x gdp x alf（x）遷移状態アナログの1つの構造モデルが知られており、これは反応パスウェイに沿った「スナップショット」を表しています。現在明らかになったように、Ras X GTPへのギャップの結合は、ガンマからリン酸ベータに負の電荷をシフトします。このようなシフトは、RAS結合のためにGTPのFTIRによってすでに特定されており、現在ではギャップ結合によって強化されることが示されています。したがって、ギャップx ras x GTP複合体の電荷分布は、より解離性のような遷移状態に似ており、GDPのようなものに似ているため、活性化自由エネルギーが減少します。ベータリン酸ガンマとリン酸ガンマの結合が切断されると現れる反応経路で中間体が観察されます。中間体では、放出されたp（i）はタンパク質に強く縛られ、驚くべきことに、リン酸化された酵素中間体の典型的なバンドを示しています。これらの結果はすべて、Rasの固有のGTPase反応とは異なる機構的な絵を提供します。FTIR分析により、ギャップ触媒反応の速度制限ステップとして、タンパク質複合体からのP（I）の放出が明らかになりました。提示されたアプローチは、単一タンパク質だけでなく、原子レベルでリアルタイムで、非結晶状態の固有の発色状態のないタンパク質間相互作用の研究を可能にします。

The molecular reaction mechanism of the GTPase-activating protein (GAP)-catalyzed GTP hydrolysis by Ras was investigated by time resolved Fourier transform infrared (FTIR) difference spectroscopy using caged GTP (P(3)-1-(2-nitro)phenylethyl guanosine 5'-O-triphosphate) as photolabile trigger. This approach provides the complete GTPase reaction pathway with time resolution of milliseconds at the atomic level. Up to now, one structural model of the GAP x Ras x GDP x AlF(x) transition state analog is known, which represents a "snap shot" along the reaction-pathway. As now revealed, binding of GAP to Ras x GTP shifts negative charge from the gamma to beta phosphate. Such a shift was already identified by FTIR in GTP because of Ras binding and is now shown to be enhanced by GAP binding. Because the charge distribution of the GAP x Ras x GTP complex thus resembles a more dissociative-like transition state and is more like that in GDP, the activation free energy is reduced. An intermediate is observed on the reaction pathway that appears when the bond between beta and gamma phosphate is cleaved. In the intermediate, the released P(i) is strongly bound to the protein and surprisingly shows bands typical of those seen for phosphorylated enzyme intermediates. All these results provide a mechanistic picture that is different from the intrinsic GTPase reaction of Ras. FTIR analysis reveals the release of P(i) from the protein complex as the rate-limiting step for the GAP-catalyzed reaction. The approach presented allows the study not only of single proteins but of protein-protein interactions without intrinsic chromophores, in the non-crystalline state, in real time at the atomic level.