Saccharomyces cerevisiaeのグリオキサラーゼIおよびグリオキサラーゼIIのin situ速度分析

グリオキサラーゼI [（r）-S-Lactoylglutathioneメチルグリオキサールリアーゼの動態;EC 4.4.1.5]およびグリオキサラーゼII（S-2-ヒドロキシアシルグルタチオーゼヒドロラーゼ; EC 3.1.2.6）saccharomyces cerevisiaeは、2つの異なるアプローチを使用して、デジトニン浸透細胞でその場で研究されました：初期レート分析と進行曲線分析。初期速度分析は、プログラムHyperFitを使用して初期レートの双曲線回帰によって実行されました。グリオキサラーゼIは、0.05-2.5 mm hemithioacetal濃度範囲で飽和速度論を示し、速度論的パラメーターkm 0.53 +/- 0.07 mmおよびV（3.18 +/- 0.16）x 10（-2）mmmin（-1）。グリオキサラーゼIIは、0.15-3 mmおよびkm 0.32 +/- 0.13 mmおよびV（1.03 +/- 0.10）x 10（-3）mmm（-1）のSd-Lactoylglutathione濃度範囲で飽和動態を示しました。。両方の酵素の速度論的パラメーターは、生の吸光度データとプログラムGEPASIと統合された微分速度方程式を使用した進行曲線の非線形回帰によっても推定されました。いくつかの最適化方法を使用して、残差の正方形の合計を最小限に抑えました。グリオキサラーゼI反応に適した最適なパラメーターは、不可逆的なMichaelis-Mentenモデルを使用して、単一の曲線分析で得られました。得られた速度論的パラメーター、km 0.62 +/- 0.18 mmおよびV（2.86 +/- 0.01）x 10（-2）mm.min（-1）は、初期レート分析によって得られたものと一致していました。不可逆的なミカエリス・メンテンモデルまたは現象学的可逆的双曲線モデルのいずれかを使用して、グリオキサラーゼIIについて得られた結果は、kmに関連する標準偏差の時間および/または高い値との残差の高い相関を示しました。グリオキサラーゼIIについて、初期レート分析と進行曲線分析から得られたデータ間の矛盾の可能性のある原因について説明します。

The kinetics of glyoxalase I [(R)-S-lactoylglutathione methylglyoxal-lyase; EC 4.4.1.5] and glyoxalase II (S-2-hydroxyacylglutathione hydrolase; EC 3.1.2.6) from Saccharomyces cerevisiae was studied in situ, in digitonin permeabilized cells, using two different approaches: initial rate analysis and progress curves analysis. Initial rate analysis was performed by hyperbolic regression of initial rates using the program HYPERFIT. Glyoxalase I exhibited saturation kinetics on 0.05-2.5 mM hemithioacetal concentration range, with kinetic parameters Km 0.53 +/- 0.07 mM and V (3.18 +/- 0.16) x 10(-2) mM.min(-1). Glyoxalase II also showed saturation kinetics in the SD-lactoylglutathione concentration range of 0.15-3 mM and Km 0.32 +/- 0.13 mM and V (1.03 +/- 0.10) x 10(-3) mM.min(-1) were obtained. The kinetic parameters of both enzymes were also estimated by nonlinear regression of progress curves using the raw absorbance data and integrated differential rate equations with the program GEPASI. Several optimization methods were used to minimize the sum of squares of residuals. The best parameter fit for the glyoxalase I reaction was obtained with a single curve analysis, using the irreversible Michaelis-Menten model. The kinetic parameters obtained, Km 0.62 +/- 0.18 mM and V (2.86 +/- 0.01) x 10(-2) mM.min(-1), were in agreement with those obtained by initial rate analysis. The results obtained for glyoxalase II, using either the irreversible Michaelis-Menten model or a phenomenological reversible hyperbolic model, showed a high correlation of residuals with time and/or high values of standard deviation associated with Km. The possible causes for the discrepancy between data obtained from initial rate analysis and progress curve analysis, for glyoxalase II, are discussed.