大腸菌で発現した別々の逆転写酵素ドメインからの機能的アヒル肝炎ウイルス複製開始複合体の再構成

B型肝炎ウイルスは、RNA中間体、プレゲノムRNA（PGRNA）の逆転写を介して複製します。複製はnovoで開始され、ウイルス逆転写酵素（Pタンパク質）、pGRNA上のRNAステムループ構造（エプシロン）、および熱ショックタンパク質HSP90、コチャペロンP23を含む細胞タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体の形成が必要です。さらに、まだ未知の要因。機能的複合体は、Epsilonによってテンプレートされ、Pタンパク質の末端タンパク質（TP）ドメインに共有結合した短いDNAプライマーの合成を触媒します。現在、試験管内でそのような複合体を生成する唯一のシステムは、ウサギ網状細胞溶解物（RRL）のアヒル肝炎ウイルス（DHBV）Pタンパク質のin vitro翻訳であり、これも必要な要因を提供します。ただし、その限られた翻訳能力は、複合体のより緊密な分析を妨げています。この制限を克服するために、大腸菌で発現することにより、大量のDHBV Pタンパク質を生成しようとし、その後RRLで複雑な再構成を行いました。細菌で全長Pタンパク質を生成しようとする以前の試みが失敗したため、TPと逆転写酵素-RNase H（RT-RH）ドメインの別々の発現がより高い収率を可能にするかどうか、およびこれらのドメインが互いに補完できるかどうかを調査しました。実際、TPおよび、マイナーなC末端修飾の後、RT-RHもかなりの量で発現することができ、RRLに追加すると、エプシロン依存性DNAプライマー合成が可能であり、翻訳後の活性化を実証しました。この再構成システムは、ユニークな肝臓の複製開始メカニズムを詳細に理解するための道を開く必要があります。

Hepatitis B viruses replicate through reverse transcription of an RNA intermediate, the pregenomic RNA (pgRNA). Replication is initiated de novo and requires formation of a ribonucleoprotein complex comprising the viral reverse transcriptase (P protein), an RNA stem-loop structure (epsilon) on the pgRNA, and cellular proteins, including the heat shock protein Hsp90, the cochaperone p23, and additional, as yet unknown, factors. Functional complexes catalyze the synthesis of a short DNA primer that is templated by epsilon and covalently linked to the terminal protein (TP) domain of P protein. Currently, the only system for generating such complexes in the test tube is in vitro translation of duck hepatitis B virus (DHBV) P protein in rabbit reticulocyte lysate (RRL), which also provides the necessary factors. However, its limited translation capacity precludes a closer analysis of the complex. To overcome this restriction we sought to produce larger amounts of DHBV P protein by expression in Escherichia coli, followed by complex reconstitution in RRL. Because previous attempts to generate full-length P protein in bacteria have failed we investigated whether separate expression of the TP and reverse transcriptase-RNase H (RT-RH) domains would allow higher yields and whether these domains could trans complement each other. Indeed, TP and, after minor C-terminal modifications, also RT-RH could be expressed in substantial amounts, and when added to RRL, they were capable of epsilon-dependent DNA primer synthesis, demonstrating posttranslational activation. This reconstitution system should pave the way for a detailed understanding of the unique hepadnaviral replication initiation mechanism.