オイルレッドO染色の最適化により、免疫蛍光と脂質の自動定量化との組み合わせにより

本研究の目的は、蛍光顕微鏡による他の心細胞成分の免疫局在とともに、骨格筋切片における骨格筋切片における筋細胞脂質沈着の自動定量化を許可する染色を開発することでした。脂質液滴は、オイルレッドO（ORO）によって骨格筋で検出されました。従来のOROは、バックグラウンド染色を減らし、OROの結晶化を防ぎ、凍結切片の脂質保持を最適化するように修正されました。これらの修飾により、従来のOROによるやや拡散染色ではなく、脂質液滴の点状染色が生じました。筋肉切片（小さな血管の内腔など）の小さな空洞は、ここに示されているプロトコルを使用するとOROを欠いています。さらに、OROと免疫蛍光を組み合わせた染色プロトコルが提示されます。この組み合わせにより、同じセクションで複数の染色研究が可能になります。したがって、脂質液滴は、脂質の取り扱いと代謝に関与するタンパク質の免疫標識と一緒に研究することができます。これにより、脂質沈着の局在化に関連して、脂質処理タンパク質（すなわち酵素と脂肪酸輸送タンパク質）の細胞内局在に関する知識が拡大します。結論として、ここで提示されたプロトコルは、定量的蛍光顕微鏡による骨格筋に存在する他の免疫検出可能なタンパク質の複数の染色とともに、骨格筋切片におけるORO染色脂質滴の検査を許可します。

The objective of the present study was to develop a stain permitting automated quantification of myocellular lipid depositions in skeletal muscle sections together with immunolocalisation of other myocellular constituents by fluorescence microscopy. Lipid droplets were detected in skeletal muscle by oil red O (ORO). Conventional ORO was modified to diminish background staining, prevent crystallisation of ORO and to optimise lipid retention in cryosections. These modifications resulted in a punctate staining of lipid droplets, rather than the somewhat diffuse staining by conventional ORO. Small cavities in muscle sections (like the lumen of small blood vessels) lack ORO when using the protocol presented here. In addition a staining protocol is presented combining ORO with immunofluorescence. This combination permits multiple staining studies in the same section. Thus, lipid droplets can be studied together with immunolabelling of proteins involved in lipid handling and metabolism. This will extend our knowledge on the subcellular localisation of lipid handling proteins (i.e. enzymes and fatty acid transporting proteins) in relation to the localisation of lipid depositions. In conclusion, the protocol presented here permits examination of ORO-stained lipid droplets in skeletal muscle sections together with multiple staining of other immunodetectable proteins present in skeletal muscle by quantitative fluorescence microscopy.