ヨードアセトアミドによるタンパク質消化の過剰アルキル化

タンパク質のシスチン結合は、多くの場合、消化を改善するために還元剤で開かれ、多くの場合、消化物の複雑な分析からジスルフィド結合を排除します。還元後、スルフヒドリルは通常、ヨードアセトアミド（IAM）、ヨード酢酸（IAA）、またはランダムな方法でジスルフィド結合の再形成を防ぐための別の電気帯と反応します。タンパク質の量を確実に推定できる場合、過剰なIAMまたはIAAからの副作用を回避できます。そうでない場合、過剰なヨードアルカンの除去は、HPLC、透析、または単にチオールが過剰を消費することを許可することによって達成できます。1Dまたは2Dゲルによって分離されたタンパク質の質量分析では、過剰なヨードアルカンの除去は、タンパク質分解消化の前にゲルを洗浄するだけで多くの場合に達成されます。アクチンのグルタチオン化部位マッピングの最近の研究中に、IAMはタンパク質に残っている残留スルフヒドリル基をブロックして、最初の部位からグルタチオンを置き換えないようにしました。さらに、透析中のアクチン重合による損失を回避するために、IAMは消化中に残ることが許可されました。これにより、消化中に解放されたスルフヒドリル群がIAMによって同様にブロックされることがさらに保証されました。これらの条件下では、ペプチドがN-およびS-カルバミドメチル化を受けることを観察しました。このようにIAMでアルキル化された他の一連のペプチドを調べる際に、n-アルキル化が例外ではなくルールであることがわかり、o-アルキル化さえ検出されました。カルバミドメチル基がペプチドに付着する主な部位は、イオントラップ質量分析計を使用してLC-MS2を使用して配置され、N末端アミノ基であることがわかりました。過剰な還元剤を避けなければならない場合のそのような反応を防ぐための単純な手段は、チオールではなく2,2'-チオディエタノールなどのチオエーテルの存在下でアルキル化を実行することです。

Cystine linkages in proteins are often opened with reducing agents, sometimes to improve their digestion, often to eliminate disulfide linkages from complicating analysis of the digest. After reduction, the sulfhydryls are usually reacted with iodoacetamide (IAM), iodoacetic acid (IAA), or another electrophile to prevent reformation of disulfide linkages in a random manner. When the amount of protein may be reliably estimated, side reactions from excess IAM or IAA can be avoided. When this is not so, removal of excess iodoalkane can be accomplished by HPLC, by dialysis, or simply by allowing a reducing thiol to consume any excess. In mass spectrometric analysis of proteins isolated by 1D or 2D gels, removal of the excess iodoalkane is often accomplished simply by washing the gel prior to proteolytic digestion. During a recent study of the glutathionylation site mapping of actin, IAM was used to block any residual sulfhydryl groups remaining on the protein so that they would not displace glutathione from its initial site. In addition, to avoid losses due to actin polymerization during dialysis, the IAM was allowed to remain during the digestion. This further ensured that any sulfhydryl groups liberated during the digestion would be similarly blocked by the IAM. Under these conditions, we observed the peptides to undergo N- as well as S-carbamidomethylation. In examining a series of other peptides alkylated with IAM in this way, we have found N-alkylation to be the rule rather than the exception and even O-alkylation was detected. The main sites to which the carbamidomethyl group attaches to the peptides have been located with LC-MS2 using an ion trap mass spectrometer and found to be the N-terminal amino group. A simple expedient to prevent such reactions when an excess of reducing agent must be avoided is to run the alkylation in the presence of a thioether such as 2,2'-thiodiethanol rather than a thiol.