新規相互作用パートナーとしての6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼのファージ分散ペプチドライブラリの識別によるグルコキナーゼ結合タンパク質エピトープの特性評価

低親和性グルコースリン酸化酵素グルコキナーゼは、膵臓および肝臓のベータ細胞における細胞内転座の現象を示しています。体系的な戦略によってグルコキナーゼの潜在的な結合パートナーを特定するために、ヒトベータ細胞グルコキナーゼは、M13ファージによって表示される12-MERランダムペプチドライブラリーによってスクリーニングされました。このパン化手順により、グルコキナーゼに対する高い結合親和性を持つ2つのコンセンサスモチーフが明らかになりました。最初のコンセンサスモチーフであるLsaxxvagは、肝臓のグルコキナーゼ調節タンパク質に対応していました。2番目のコンセンサスモチーフであるSLKVWTは、グルコース代謝の重要な調節因子として作用する二機能酵素6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ（PFK-2/FBPase-2）との完全な相同性を示しました。酵母の2ハイブリッド分析により、グルコキナーゼのPFK-2/FBPase-2への結合がビスホスファターゼドメインによって付与されるのに対し、キナーゼドメインは二量体化の原因であることが明らかになりました。cDNA端分析とノーザンブロット分析の5'レイピッド増幅により、ラットの膵島はPFK-2/FBPase-2の脳アイソフォームを発現することが明らかになりました。膵島PFK-2/FBPase-2 cDNAクローンの少数は、キナーゼドメインに8つの追加のアミノ酸を含む新規スプライスバリアントを構成していました。膵島/脳PFK-2/ FBPase-2アイソフォームのグルコキナーゼの結合は、肝臓アイソフォームの結合と同等でした。グルコキナーゼとPFK-2/FBPase-2の相互作用は、グルコキナーゼとグリコリ溶解酵素の間のグリコリ溶解中間体のフルクトース-2,6-ビスリン酸レベル依存性部分チャネリングの最近の観察の理論的根拠を提供する可能性があります。膵臓ベータ細胞では、この相互作用には、代謝刺激分泌カップリングの調節機能がある場合があります。フルクトース-2,6-ビスリン酸レベルの変化とPFK-2/FBPase-2活性の変調は、グルコキナーゼ媒介グルコース誘発インスリン分泌の生理学的調節に関与する可能性があります。

The low affinity glucose-phosphorylating enzyme glucokinase shows the phenomenon of intracellular translocation in beta cells of the pancreas and the liver. To identify potential binding partners of glucokinase by a systematic strategy, human beta cell glucokinase was screened by a 12-mer random peptide library displayed by the M13 phage. This panning procedure revealed two consensus motifs with a high binding affinity for glucokinase. The first consensus motif, LSAXXVAG, corresponded to the glucokinase regulatory protein of the liver. The second consensus motif, SLKVWT, showed a complete homology to the bifunctional enzyme 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2), which acts as a key regulator of glucose metabolism. Through yeast two-hybrid analysis it became evident that the binding of glucokinase to PFK-2/FBPase-2 is conferred by the bisphosphatase domain, whereas the kinase domain is responsible for dimerization. 5'-Rapid amplification of cDNA ends analysis and Northern blot analysis revealed that rat pancreatic islets express the brain isoform of PFK-2/FBPase-2. A minor portion of the islet PFK-2/FBPase-2 cDNA clones comprised a novel splice variant with 8 additional amino acids in the kinase domain. The binding of the islet/brain PFK-2/ FBPase-2 isoform to glucokinase was comparable with that of the liver isoform. The interaction between glucokinase and PFK-2/FBPase-2 may provide the rationale for recent observations of a fructose-2,6-bisphosphate level-dependent partial channeling of glycolytic intermediates between glucokinase and glycolytic enzymes. In pancreatic beta cells this interaction may have a regulatory function for the metabolic stimulus-secretion coupling. Changes in fructose-2,6-bisphosphate levels and modulation of PFK-2/FBPase-2 activities may participate in the physiological regulation of glucokinase-mediated glucose-induced insulin secretion.