チーズスターターの透過と溶解を監視するための蛍光方法

ライブ/デッドバクライトの細菌生存率キットを使用したデュアル染色を使用して、チーズスターターバクテリアの溶解を監視する蛍光法について説明します。このキットは、膜透過性の緑色の蛍光核酸色素Syto 9と膜浸透性赤色蛍光核酸色素ヨウ化プロピジウム（PI）を組み合わせ、損傷した膜細胞を染色して蛍光赤と無傷の細胞蛍光緑色を染色します。蛍光法の評価のために、Lactococcus lactis Mg1363の細胞を異なる条件下でインキュベートし、その後SYTO 9およびPIで標識し、フローサイトメトリーと過蛍光顕微鏡で分析しました。溶解は、細胞壁溶解酵素ムタノリシンによる治療により誘導されました。チーズの状態は、高タンパク質、カリウム、マグネシウムを含む緩衝液に細胞をインキュベートすることで模倣され、細胞を安定させました。非安定化条件下では、高濃度のムタノリシンが細胞の完全な破壊を引き起こしました。これにより、細胞の総数が減少し、細胞質酵素乳酸デヒドロゲナーゼが放出されました。安定化バッファーでは、ムタノリシンも膜損傷を引き起こしましたが、細胞ははるかに低い速度で崩壊しました。安定化バッファーは、多数のPI標識細胞によって示されるように、透過性細胞を支持しました。さらに、透過性細胞は細胞内アミノペプチダーゼNを放出しませんでしたが、外部添加および非透過性ペプチド基質リシル-P-ニトロアニリドで酵素活性の増加が観察されました。最後に、これらの染色と共焦点スキャンレーザー顕微鏡では、チーズ中のスターター細胞の透過化を分析することができました。

A fluorescence method to monitor lysis of cheese starter bacteria using dual staining with the LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit is described. This kit combines membrane-permeant green fluorescent nucleic acid dye SYTO 9 and membrane-impermeant red fluorescent nucleic acid dye propidium iodide (PI), staining damaged membrane cells fluorescent red and intact cells fluorescent green. For evaluation of the fluorescence method, cells of Lactococcus lactis MG1363 were incubated under different conditions and subsequently labeled with SYTO 9 and PI and analyzed by flow cytometry and epifluorescence microscopy. Lysis was induced by treatment with cell wall-hydrolyzing enzyme mutanolysin. Cheese conditions were mimicked by incubating cells in a buffer with high protein, potassium, and magnesium, which stabilizes the cells. Under nonstabilizing conditions a high concentration of mutanolysin caused complete disruption of the cells. This resulted in a decrease in the total number of cells and release of cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase. In the stabilizing buffer, mutanolysin caused membrane damage as well but the cells disintegrated at a much lower rate. Stabilizing buffer supported permeabilized cells, as indicated by a high number of PI-labeled cells. In addition, permeable cells did not release intracellular aminopeptidase N, but increased enzyme activity was observed with the externally added and nonpermeable peptide substrate lysyl-p-nitroanilide. Finally, with these stains and confocal scanning laser microscopy the permeabilization of starter cells in cheese could be analyzed.