プラスミドDNAと自己活性化レンチウイルスベクターの両方における遺伝子発現の効率的な制御のための単一の調節モジュールの設計とin vitro特性評価

背景：標的細胞における導入遺伝子発現の調節は、遺伝子治療の重要かつ挑戦的な側面を表しています。最近、TETTR-VP16融合誘導体ではなく、テトラサイクリンリプレッサー（TERT）のみが、2つのタンデムリピートを含む2番目のプラスミドの強力なトランス変更装置として機能することが示された2プラスミドテトラサイクリン誘導系のシステムが開発されました。TATAボックスとHCMVメジャーの即時エリアプロモーターの転写開始部位の間に挿入されたテトラサイクリン演算子（TETO）の。この分野での技術的進歩は、これらの成分の両方を非ウイルスおよびウイルス遺伝子転移ベクターに組み込む単一の自己調節カセットの開発です。後者の場合、分裂細胞または非分化細胞のいずれかで遺伝子発現の時間的および定量的制御が可能な誘導性レンチウイルスベクターが非常に望ましいです。 材料と方法：TETTRのIRESを介した翻訳と、テトラサイクリンの非存在下での最初のCistronの転写開始を防ぐTETOユニットの緊密な制御を提供するために、ワンピース誘導（1PI）自己調節カセットが構築されました。TERTを介した抑制の効率を高めるために、TERT遺伝子の3 '末端に核局在化信号が組み込まれました。転写およびタンパク質レベルでの遺伝子発現の調節は、プラスミドDNAを使用した過渡性トランスフェクション実験で分析されました。この1PIカセットを含む自己活動性のレンチウイルスベクターの構築により、一次ヒト細胞における長期的な有効性の研究が可能になりました。 結果：プラスミドDNAに組み込まれた場合の1PI自己調節カセットにより、秘密のHEGFの効率的な制御と、さまざまな細胞タイプでのEGFP発現が可能になります。一時的なトランスフェクション研究により、抑制の時間経過は1PIおよび2プラスミドシステム（2PI）で異なることが実証されました。2PIシステムでは、最初の24〜48時間でより大きな抑制が見られます。ただし、72時間までに、1PIおよび2PIシステムでの同様のレベルの抑制が取得されます。この規制は、核局所化信号でTERTが修正され、新生タンパク質を核コンパートメントに向けると3倍速く到達します。さらに、この単一の調節因子カセットを組み込んだ自己活性化レンチウイルスベクターを使用したヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の安定した形質導入により、テトラサイクリン誘導性のコントロールは、テトラサイクリンの除去時に完全に逆転する遺伝子発現の誘導性コントロールを提供しました。 結論：これらの結果は、1PIの自己調節システムが時間の経過とともに定常状態に到達するモデルを示唆しています。CMVプロモーターの基礎活性によって生成され、蓄積されたTETRの最小量は、時間の経過とともに失われたTERTを置き換えるのに十分です。これらの研究はまた、誘導性の自己活動性レンチウイルスベクターが、Huvecsの導入遺伝子発現を時間的かつ可逆的に調節できることを示しています。非ウイルスおよびウイルスベクター送達システムの両方でこの転写制御ユニットを使用することは、遺伝子発現の時間的および定量的制御が望まれる多くの遺伝子治療アプリケーションにとって魅力的な技術的進歩を構成します。1PIシステムの長所と制限について説明します。

BACKGROUND: Regulation of transgene expression in target cells represents a critical and challenging aspect of gene therapy. Recently, a two-plasmid tetracycline-inducible system was developed in which the tetracycline repressor (tetR) alone, rather than the tetR-VP16 fusion derivative, was shown to function as a potent trans-modulator of a second plasmid that contains two tandem repeats of the tetracycline operator (tetO) inserted between the TATA box and the transcription start site of the hCMV major immediate-early promoter. A technological advance in this area would be the development of a single autoregulatory cassette that incorporates both of these components into nonviral and viral gene transfer vectors. For the latter, an inducible lentiviral vector that is capable of temporal and quantitative control of gene expression in either dividing or nondividing cells is highly desirable. MATERIALS AND METHODS: A one-piece inducible (1Pi) autoregulatory cassette was constructed to provide IRES-mediated translation of the tetR as well as tight control over the tetO unit preventing transcription initiation of the first cistron in the absence of the tetracycline. To increase efficiency of tetR-mediated repression, a nuclear localization signal was incorporated at the 3' end of the tetR gene. Regulation of gene expression at the transcriptional and protein level was analyzed in transient transfection experiments using plasmid DNA. Construction of a self-inactivating lentiviral vector containing this 1Pi cassette allowed the study of its long-term effectiveness in primary human cells. RESULTS: The 1Pi autoregulatory cassette when incorporated into plasmid DNA allows efficient control of the secretable hEGF as well as eGFP expression in a variety of cell types. Transient transfection studies demonstrated that the time course of repression is different for the 1Pi and two-plasmid system (2Pi). In the 2Pi system, greater repression is seen with the first 24-48 hr; however, by 72 hr, similar levels of repression with the 1Pi and 2Pi systems are obtained. This regulation is reached three times faster when the tetR is modified with a nuclear localization signal to direct nascent proteins into the nuclear compartment. In addition, stable transduction of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with a self-inactivating lentiviral vector incorporating this single regulator cassette provided tetracycline-inducible control of gene expression that is not diminished over time and is completely reversible upon removal of tetracycline. CONCLUSIONS: These results suggest a model in which the 1Pi autoregulatory system reaches a steady state over time, the minimal amount of tetR produced by the basal activity of the CMV promoter and accumulated is adequate to replace the tetR that is lost over time. These studies also show that the inducible self-inactivating lentiviral vector can temporally and reversibly regulate transgene expression in HUVECs. The use of this transcriptional control unit in both nonviral and viral vector delivery systems will constitute an attractive technological advance for many gene therapy applications where temporal and quantitative control of gene expression is desired. The strengths and limitations of the 1Pi system are discussed.