逆アゴニストは、構造を安定化し、構成的内在化とダウンレギュレーションをブロックすることにより、ラットMU-オピオイド受容体の構成的活性D349（164）Q変異体をアップレギュレートします

我々は、細胞を逆アゴニストであるナロキソンで前処理しない限り、D3.49（164）の変異がラットMU-オピオイド受容体の構成的活性化をもたらし、受容体発現を廃止したことを実証した。この研究では、D3.49（164）Q変異体の特性と、ナロキソンの効果の根底にあるメカニズムを調査しました。ナロキソン前処理は、mRNAレベルに影響を与えることなく、時間的および用量依存的にD3.49（164）Q変異体のジプレノルフィン結合とタンパク質発現をアップレギュレートしました。ナロキソン除去後、変異体の結合とタンパク質発現は、そのmRNAレベルに影響を与えずに時間とともに低下しました。ナロキソンメチオドド（第4アンモニウムアナログ）は、ナロキソン効果の約50％の最大上方制御を引き起こし、ナロキソンが細胞外および細胞内に作用することを示しています。変異体の発現は、逆アゴニスト、中性拮抗薬、アゴニストによって強化され、逆アゴニストが最も効果的です。膜では、変異体は37度Cでのインキュベーション時に野生型よりも構造的に安定性が低く、[d-ala（2）、n-me-phe（4）、gly（5）-ol]エンケファリンは変異体を安定させました。優性陰性変異体GRK2-K220R、アレスチン-2（319-418）、ダイナミンI-K44A、RAB5A-N133IまたはRAB7-N125Iの共発現により、ナロキソン除去後の変異体の結合の減少が部分的に防止されました。クロロキンまたはプロテアソーム阻害剤Iは、変異体のダウンレギュレーションを減少させました。これらの結果は、d3.49（164）Q変異体がGタンパク質カップレプレーターキナーゼ、アレスチン-2-、ダイナミン、RAB5-、およびRab7依存性経路を介して構成的に内在化され、おそらく初期および後期のエンドソームを介してリソソームに密着していることを示しています。ナロキソンは、変異タンパク質を安定化し、その構成的な内在化とダウンレギュレーションをブロックすることにより、D3.49（164）Q変異体を上方制御します。私たちの知る限り、これは逆アゴニストによる構成的活性変異体のアップレギュレーションに関与するメカニズムの最初の包括的な分析を表しています。

We demonstrated previously that D3.49(164) mutations resulted in constitutive activation of the rat mu-opioid receptor and abolished receptor expression unless cells were pretreated with naloxone, an inverse agonist. In this study, we investigated the properties of the D3.49(164)Q mutant and the mechanisms underlying the effect of naloxone. Naloxone pretreatment up-regulated [(3)H]diprenorphine binding and protein expression of the D3.49(164)Q mutant in a time- and dose-dependent manner without affecting its mRNA level. After naloxone removal, binding and protein expression of the mutant declined with time with no effect on its mRNA level. Naloxone methiodide (a quaternary ammonium analog) caused a maximal up-regulation about 50% of the naloxone effect, indicating that naloxone acts extracellularly and intracellularly. Expression of the mutant was enhanced by inverse agonists, a neutral antagonist, and agonists, with inverse agonists being most effective. In membranes, the mutant was structurally less stable than the wild type upon incubation at 37 degrees C, and naloxone and [D-Ala(2),N-Me-Phe(4),Gly(5)-ol]-enkephalin stabilized the mutant. Coexpression of the dominant-negative mutants GRK2-K220R, arrestin-2(319-418), dynamin I-K44A, rab5A-N133I or rab7-N125I partially prevented the decline in binding of the mutant after naloxone removal. Chloroquine or proteasome inhibitor I reduced the down-regulation of the mutant. These results indicate that the D3.49(164)Q mutant is constitutively internalized via G protein coupled-receptor kinase-, arrestin-2-, dynamin-, rab5-, and rab7-dependent pathways and probably trafficked through early and late endosomes into lysosomes and degraded by lysosomes and proteasomes. Naloxone up-regulates the D3.49(164)Q mutant by stabilizing the mutant protein and blocking its constitutive internalization and down-regulation. To the best of our knowledge, this represents the first comprehensive analysis of the mechanisms involved in up-regulation of constitutively active mutants by an inverse agonist.