肺炎連鎖球菌の負の選択による遺伝子置換のためのRPSLカセット、ヤヌス

自然な遺伝的変換は、合成遺伝子コンストラクトを肺炎連鎖球菌の単一の円形染色体に配置できる直接的な経路を提供します。しかし、一般的な負の選択マーカーの欠如は、選択可能な表現型を付与しない構造の導入を妨げています。カナマイシン（KN）耐性マーカー（KAN）とカウンセルセレクト可能なRPSL（+）マーカーを含む1.3 kbのカセットが構築されました。カセットは、S。pneumoniaeのSM耐性の背景にドミナントストレプトマイシン（SM）感度を付与しました。選択したターゲットサイトに任意の配列のDNAを配置するために、2段階の変換手順で使用できることが実証されました。SM耐性ひずみへの最初の変換は、カセットを使用して、同質の組換えによって染色体上の標的遺伝子にタグ付けされ、同時に組換えにSM感受性を付与しました。2回目の形質転換中のDNAの任意のセグメントによるカセットの置換により、SM抵抗が回復し（およびKN感受性）、選択可能な表現型を欠くサイレント突然変異と欠失またはその他の遺伝子置換術の構築が可能になりました。また、RECAに依存しているプロセスで2つのRPSL対立遺伝子間で遺伝子変換が発生し、ミスマッチ修復による補正の影響を受けやすいことも示されました。

Natural genetic transformation offers a direct route by which synthetic gene constructs can be placed into the single circular chromosome of Streptococcus pneumoniae. However, the lack of a general negative-selection marker has hampered the introduction of constructs that do not confer a selectable phenotype. A 1.3-kb cassette was constructed comprising a kanamycin (Kn) resistance marker (kan) and a counterselectable rpsL(+) marker. The cassette conferred dominant streptomycin (Sm) sensitivity in an Sm-resistant background in S. pneumoniae. It was demonstrated that it could be used in a two-step transformation procedure to place DNA of arbitrary sequence at a chosen target site. The first transformation into an Sm-resistant strain used the cassette to tag a target gene on the chromosome by homologous recombination while conferring Kn resistance but Sm sensitivity on the recombinant. Replacement of the cassette by an arbitrary segment of DNA during a second transformation restored Sm resistance (and Kn sensitivity), allowing construction of silent mutations and deletions or other gene replacements which lack a selectable phenotype. It was also shown that gene conversion occurred between the two rpsL alleles in a process that depended on recA and that was susceptible to correction by mismatch repair.