ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質の膜近傍ヘプタッドリピートの変異解析

Paramyxovirus Fusionタンパク質には、タンパク質の融合活性に関係している2つのHEPTADリピートドメイン、HR1およびHR2があります。これら2つのドメインのペプチドは、中央の三量体と3つの分子を形成する6本鎖コイルドコイルを形成し、中央三量体の溝内にあるHR2ヘリックスの3つの分子を形成します（Baker et al。、1999、Mol。Cell3、309; Zhao etal。2000、Proc。Natl。Acad。Sci。USA97、14172）。非保守的変異は、HR1コアトリマーと接触する可能性が高い残基で、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質のHR2ドメインで行われました。これらの残基は、らせんと隣接する残基の疎水性面を形成します（HR2ヘリカルホイール構造の「A」および「G」位置）。変異タンパク質は、合成、定常状態レベル、タンパク質分解性切断、および表面発現、ならびにシンシチア形成、含有量混合、および脂質混合によって測定される融合活性に特徴付けられました。すべての変異タンパク質は輸送能力があり、タンパク質的に切断されていましたが、これらの変異はタンパク質の融合活性にさまざまに影響しました。「G」位置の非保守的変異は、融合に影響を与えませんでした。対照的に、HR2の中央の「A」の位置の単一の変化は、脂質混合、含有量の混合、およびシンシチア形成を阻害しました。より多くのカルボキシル末端の「A」位置の単一の突然変異は、脂質混合に最小限の影響を及ぼしましたが、含有量の混合とシンシチア形成を阻害しました。これらの結果は、HR2ドメインが膜の密接なアプローチを媒介するHR1との翻訳後相互作用に関与しているという考えと一致しています。これらの結果は、HR2ドメイン、特にカルボキシル末端領域が、融合に追加の役割を果たしていることを示唆しています。これは、コンテンツのミキシングとシンシチア形成に関連する役割です。

Paramyxovirus fusion proteins have two heptad repeat domains, HR1 and HR2, that have been implicated in the fusion activity of the protein. Peptides from these two domains form a six-stranded, coiled-coil with the HR1 sequences forming a central trimer and three molecules of the HR2 helix located within the grooves in the central trimer (Baker et al., 1999, Mol. Cell 3, 309; Zhao et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14172). Nonconservative mutations were made in the HR2 domain of the Newcastle disease virus fusion protein in residues that are likely to form contacts with the HR1 core trimer. These residues form the hydrophobic face of the helix and adjacent residues ("a" and "g" positions in the HR2 helical wheel structure). Mutant proteins were characterized for effects on synthesis, steady-state levels, proteolytic cleavage, and surface expression as well as fusion activity as measured by syncytia formation, content mixing, and lipid mixing. While all mutant proteins were transport competent and proteolytically cleaved, these mutations did variously affect fusion activity of the protein. Nonconservative mutations in the "g" position had no effect on fusion. In contrast, single changes in the middle "a" position of HR2 inhibited lipid mixing, content mixing, and syncytia formation. A single mutation in the more carboxyl-terminal "a" position had minimal effects on lipid mixing but did inhibit content mixing and syncytia formation. These results are consistent with the idea that the HR2 domain is involved in posttranslational interactions with HR1 that mediate the close approach of membranes. These results also suggest that the HR2 domain, particularly the carboxyl-terminal region, plays an additional role in fusion, a role related to content mixing and syncytia formation.