ISCA、Fe-Sクラスター生合成の代替足場

ISCAに指定された（NIF）ISCAに指定されたAzotobacter VinelandiiのNIF Regulon内のISCAホモログは、大腸菌で発現し、均一性に精製されました。精製（NIF）ISCAは、その分離された形態の金属中心や他の補綴グループを含む11 kDaサブユニットのホモダイマーであることがわかりました。Fe-Sクラスター生合成における（NIF）ISCAの可能な役割は、UV-Vis吸収、Mössbauer、共鳴の組み合わせによって監視されるように、鉄を結合し、NIFS指向プロセスでFe-Sクラスターを組み立てる能力を調査することにより評価されました。ラマン、可変 - 温度磁気円双子症、およびEPR分光法。（NIF）ISCAは四面体の主にシステニル結合された配位環境で鉄イオンを結合することがわかったが、低結合親和性は、他のFe-Sクラスターアセンブリタンパク質への鉄イオンの送達のためのメタロチャペロンとしての特定の役割に対して主張します。むしろ、約1つの不安定[4FE-4S]（2+）クラスターPER（NIF）ISCAホモダイマーのNIFS指向アセンブリに基づいて、Fe-Sクラスター生合成の代替足場タンパク質としての（NIF）ISCAの役割が提案されています、一時的な[2FE-2S]（2+）クラスター中間体を介して。クラスターアセンブリプロセスは、UV-vis吸収とMössbauer分光法を使用して時間的に監視され、中間[2FE-2S]（2+）を含む種は、共鳴ラマン分光法によってさらに特徴付けられました。[2FE-2S]（2+）センターのMössbauerおよび共鳴ラマン特性は、完全なシステイニルライゲーションと一致しています。すべてのISCAタンパク質に3つの保存されたシステイン残基の存在と、ホモディマーごとに1つの[2FE-2S]（2FER-4S）または1つの[4FE-4S]（2FE-4S]（2FE-4S）の観察されたクラスター化学量論が両方のクラスタータイプがサブユニットブリッジングであることを示唆しています。さらに、（NIF）ISCAは、鉄イオンを使用してスルファン硫黄を減少させることにより、鉄と硫黄の送達を結合することが示されました。これら2つの毒性および反応性のFe-Sクラスター前駆体の送達を結合するFe-S足場タンパク質の能力は、遊離鉄および硫化物イオンの細胞濃度を最小化するために重要である可能性が高い。分光および分析の結果に基づいて、（NIF）ISCAのNIFS指向クラスターアセンブリの機械的スキームが提案されています。タンパク質のISCAファミリーは、NIF特異的および一般的なFe-Sクラスターアセンブリを媒介するために、NIFUおよびISCUタンパク質に代替足場を提供することが提案されています。

An IscA homologue within the nif regulon of Azotobacter vinelandii, designated (Nif)IscA, was expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Purified (Nif)IscA was found to be a homodimer of 11-kDa subunits that contained no metal centers or other prosthetic groups in its as-isolated form. Possible roles for (Nif)IscA in Fe-S cluster biosynthesis were assessed by investigating the ability to bind iron and to assemble Fe-S clusters in a NifS-directed process, as monitored by the combination of UV-vis absorption, Mössbauer, resonance Raman, variable-temperature magnetic circular dichroism, and EPR spectroscopies. Although (Nif)IscA was found to bind ferrous ion in a tetrahedral, predominantly cysteinyl-ligated coordination environment, the low-binding affinity argues against a specific role as a metallochaperone for the delivery of ferrous ion to other Fe-S cluster assembly proteins. Rather, a role for (Nif)IscA as an alternate scaffold protein for Fe-S cluster biosynthesis is proposed, based on the NifS-directed assembly of approximately one labile [4Fe-4S](2+) cluster per (Nif)IscA homodimer, via a transient [2Fe-2S](2+) cluster intermediate. The cluster assembly process was monitored temporally using UV-vis absorption and Mössbauer spectroscopy, and the intermediate [2Fe-2S](2+)-containing species was additionally characterized by resonance Raman spectroscopy. The Mössbauer and resonance Raman properties of the [2Fe-2S](2+) center are consistent with complete cysteinyl ligation. The presence of three conserved cysteine residues in all IscA proteins and the observed cluster stoichiometry of approximately one [2Fe-2S](2+) or one [4Fe-4S](2+) per homodimer suggest that both cluster types are subunit bridging. In addition, (Nif)IscA was shown to couple delivery of iron and sulfur by using ferrous ion to reduce sulfane sulfur. The ability of Fe-S scaffold proteins to couple the delivery of these two toxic and reactive Fe-S cluster precursors is likely to be important for minimizing the cellular concentrations of free ferrous and sulfide ions. On the basis of the spectroscopic and analytical results, mechanistic schemes for NifS-directed cluster assembly on (Nif)IscA are proposed. It is proposed that the IscA family of proteins provide alternative scaffolds to the NifU and IscU proteins for mediating nif-specific and general Fe-S cluster assembly.