CRE-LOXマウスの遺伝子型化と多重PCRによる組織特異的組換えの検出

Cre-Loxまたはその他のシステムに基づく条件付き遺伝子ターゲティングには、トランスジェニックマウス集団の頻繁な遺伝子型形成と組織特異的CRE組換え効率のモニタリングが必要です。これは現在、尾部および組織由来のDNAからの南部分析によって達成されています。フロックス（LOXPサイトが挟まれた）ゲノム領域の多重PCR増幅と、CRE導入遺伝子のPCR検出と組み合わせて、このタスクを簡素化します。ここでは、3つの適切に配置されたプライマーでフロックスされた遺伝子座の完全なジェノタイピングが可能であり、CREトランスジェンを検出するためのユニバーサルPCRアッセイでこのトリプレックスPCRを同時に実行できることを示します。このアプローチを使用して、ゲノムDNAサンプルにおける再結合と非組織化フロックスゲノムセグメントの比率も決定しました。これにより、南部分析には小さすぎる生検と組織サンプルからの生体内条件不活性化の効率を推定することができました。多くの新しい条件付きノックアウトが空間的に制限されているため、このようなアッセイはますます有用になります。提案されているPCR戦略は柔軟であり、ターゲット遺伝子の構造特異性に適応する場合があります。

Conditional gene targeting, based on Cre-lox or other systems, requires frequent genotyping of transgenic mouse populations and monitoring of tissue-specific Cre recombinatory efficiency. This is currently achieved by Southern analysis from tail- and tissue-derived DNA. Multiplex PCR amplification of the floxed (flanked by loxP sites) genomic region, combined with the PCR detection of the Cre transgene, simplifies this task. Here, we show that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers and that this triplex PCR can be performed simultaneously with a universal PCR assay for the detection of Cre transgenes. Using this approach, we also determined the ratios of recombined versus non-recombined floxed genomic segments in genomic DNA samples. This allowed us to estimate the efficiency of in vivo conditional inactivation from biopsy material and tissue samples that were too small for Southern analysis. As many new conditional knockouts are spatiotemporally restricted, such assays will become increasingly useful. The proposed PCR strategy is flexible and may be adapted to the structural specificities of any target gene.