ペントバルビタールによるGABA（a）受容体チャネルゲーティングの変調

1.細胞胚性腎臓293細胞で一時的に発現した組換えアルファアルファ1ベータ2ガンマ2L GABA（a）受容体のチャネルゲーティングの速度論的特性を研究しました。受容体は、GABA、ベータアラニンまたはピペリジン-4-スルホン酸（P4S）によって活性化され、単一チャネル活性に対するペントバルビタール（PB）の効果を調べました。2.比較的高い濃度のアゴニストでは、明確に定義されたクラスターでシングルチャネル活性が発生しました。グローバルに言えば、PBは、平均閉鎖時間を変更することなく、クラスターでのイベントの平均オープン時間を増やしました。PBの添加により、クラスター（P（O））で開いている確率に関連する曲線がアゴニスト濃度を低下させ、そのシフトは平均オープン時間の変化によって説明できました。3.クラスター内の閉鎖ヒストグラムには、4つのコンポーネントが含まれていました。これらの閉じた居住地成分の持続時間と相対頻度は、あらゆるアゴニスト濃度で40ミクロムPBの存在によって影響を受けませんでした。1つの成分の持続時間は、受容体を活性化するために使用されるアゴニストの濃度に依存していました。したがって、このコンポーネントの平均期間の逆は、有効な開口レートと呼ばれます。4.チャネルオープニング速度定数（ベータ）は、飽和アゴニスト濃度での有効な開口速度の値から決定されました。ベータは、ベータアラニンによって活性化されたときにGABAによって受容体が活性化され、1500秒（-1）で、P4Sが投与されたときに決定するには低すぎる1900秒（-1）でした。40ミクロムPBの存在下では、ベータはGABAによって活性化されたときに約1500秒（-1）、ベータアラニンによって活性化された場合は1400秒（-1）、P4Sで活性化されると50秒（-1）でした。したがって、Pbの増強効果は、ベータの変化によって媒介されません。半最大の有効開口率を生成するアゴニストの濃度もPBの存在下では影響を受けず、アゴニストに対する受容体親和性がPBの影響を受けないことを示しています。5. GABAによって誘発されたクラスター内のオープン期間の分布は、3つの指数関数の合計で説明でき、平均期間は約0.4、2.4、および6.3 msです。コンポーネントの持続時間と相対頻度は、GABA濃度（20ミクロムから1 mm）で変化しませんでした。ただし、40ミクロムPBの存在下では、オープンタイムの最長の平均期間が増加しました（平均期間は約0.4、2.0、13ミリ秒）。ベータアラニンによって誘発されたクラスター内のオープン期間は、2つの指数成分（1.1および3.5 ms）の合計で説明できます。ただし、40ミクロムPBの存在下では、オープンタイム分布には3つの指数成分（0.2、2、10 ms）が含まれていました。最後に、P4Sによって誘発された開口部は、2つのコンポーネント（0.3および0.9 ms）を示しました。40ミクロムPbの存在下では、3つの成分を区別できます（0.5、2.5、13 ms）。6.これらの観察結果は、GABA型A（GABA（a））受容体に対するPbの増強効果が、受容体の開放状態に対する効果を反映していることを示しています。GABAによって活性化された受容体の場合、観察結果は、作用がPBが開いた状態の1つを安定化した結果であるという考えと一致しています。P4Sまたはベータアラニンによって活性化された受容体に対する作用も、この考えとほぼ一致しています。ただし、PBによって引き起こされるオープンタイム分布の変化は、より複雑であるように見えます。さまざまなアゴニストによるゲーティングに対するPBの影響の可能な説明が考慮されます。

1. We have studied the kinetic properties of channel gating of recombinant alpha 1 beta 2 gamma 2L GABA(A) receptors transiently expressed in human embryonic kidney 293 cells, using the cell-attached, single-channel patch-clamp technique. The receptors were activated by GABA, beta-alanine or piperidine-4-sulfonic acid (P4S), and the effects of pentobarbital (PB) on single-channel activity were examined. 2. At relatively high concentrations of agonist, single-channel activity occurred in well-defined clusters. In global terms, PB increased the mean open time for events in clusters, without changing the mean closed time. The addition of PB shifted the curve relating the probability of being open in a cluster (P(o)) to lower agonist concentrations, and that shift could be accounted for by the changes in mean open time. 3. The intracluster closed-time histograms contained four components. The durations and relative frequencies of these closed-dwell components were not affected by the presence of 40 microM PB, at any agonist concentration. The duration of one component was dependent upon the concentration of agonist used to activate the receptor. Accordingly, the inverse of the mean duration of this component will be called the effective opening rate. 4. The channel-opening rate constant (beta) was determined from the value of the effective opening rate at a saturating agonist concentration. beta was about 1900 s(-1) when the receptors were activated by GABA, 1500 s(-1) when activated by beta-alanine, and too low to be determined when P4S was administered. In the presence of 40 microM PB, beta was about 1500 s(-1) when the receptors were activated by GABA, 1400 s(-1) when activated by beta-alanine, and 50 s(-1) when activated by P4S. Hence, the potentiating effect of PB is not mediated by a change in beta. The concentration of agonist producing a half-maximal effective opening rate also remained unaffected in the presence of PB, indicating that receptor affinity for agonists is not influenced by PB. 5. The distributions of the intracluster open durations elicited by GABA could be described by the sum of three exponentials, with mean durations of about 0.4, 2.4 and 6.3 ms. The duration and relative frequency of the components did not change with GABA concentration (20 microM to 1 mM). In the presence of 40 microM PB, however, the mean duration of the longest of the open times increased (mean durations of about 0.4, 2.0 and 13 ms). The intracluster open durations elicited by beta-alanine could be described by the sum of two exponential components (1.1 and 3.5 ms). However, in the presence of 40 microM PB the open-time distribution contained three exponential components (0.2, 2 and 10 ms). Finally, openings elicited by P4S exhibited two components (0.3 and 0.9 ms). In the presence of 40 microM PB, three components could be distinguished (0.5, 2.5 and 13 ms). 6. These observations indicate that the potentiating effect of PB on GABA type A (GABA(A)) receptors reflects effects on the open state(s) of the receptors. In the case of receptors activated by GABA, the observations are consistent with the idea that the action is the result of PB stabilizing one of the open states. The actions on receptors activated by P4S or beta-alanine are also broadly consistent with this idea. However, the changes in open-time distributions caused by PB appear to be more complex. Possible explanations of the effects of PB on gating by different agonists are considered.