プラスミドR64薄型生合成に必要な遺伝子：PILK、PILM、PILO、PILP、PILR、およびPILT遺伝子の産物の同定と局在化

プラスミドR64のピル、ピル、ピルク、ピル、ピル、ピルフ遺伝子は、それぞれ薄膜のリポタンパク質、セクレチン、細胞質ATPase、メジャーピリン、ペリチリンペプチダーゼ、およびマイナーピリンをエンコードすることを以前に示しました。枕の形成。この作業では、残りの必須遺伝子、PILK、PILM、PILO、PILP、PILR、およびPILTの産物を特徴付けました。N末端グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）と融合したPILM、PILO、およびPILP遺伝子を含む過剰発現システムまたはHISタグが構築されました。過剰生産されたタンパク質を精製し、特定の抗体を上げるために使用しました。PILM、PILO、およびPILPタンパク質の局在化は、それぞれ抗GST-PILM、抗PILO、および抗PILP抗体を使用したウエスタンブロット分析によって実施されました。PILK、PILR、およびPILT製品は、C末端の彼のタグで生産され、抗HISタグ抗体によって検出されました。R64薄型を産生する大腸菌細胞を用いた細胞内分画実験により、PILK、PILM、およびPILRが内膜タンパク質であり、脈拍とピルトがペリプラズムタンパク質であることが明らかになりました。PILOタンパク質は、他のPILタンパク質の存在下で外膜に局在していましたが、これらのタンパク質の非存在下では細胞質に局在していました。さらに、PILPタンパク質の切断部位は、精製成熟PILPタンパク質のN末端アミノ酸配列決定によって決定されました。私たちは、ピルリン輸送装置と薄型基底体の成分としてpILK、著名な、柱、乳重、およびピルトタンパク質が機能すると予測しています。

We have previously shown that the pilL, pilN, pilQ, pilS, pilU, and pilV genes of plasmid R64 encode outer membrane lipoprotein, secretin, cytoplasmic ATPase, major pilin, prepilin peptidase, and minor pilin, respectively, which are required for thin-pilus formation. In this work, we characterized the products of the remaining essential genes, pilK, pilM, pilO, pilP, pilR, and pilT, with regard to their localization and processing. Overexpression systems containing pilM, pilO, and pilP genes fused with N-terminal glutathione S-transferase (GST) or a His tag were constructed. Overproduced proteins were purified and used to raise specific antibodies. Localization of PilM, PilO, and PilP proteins was performed by Western blot analysis with anti-GST-PilM, anti-PilO, and anti-PilP antibodies, respectively. The pilK, pilR, and pilT products were produced with a C-terminal His tag and then detected by anti-His tag antibody. Subcellular fractionation experiments with Escherichia coli cells producing R64 thin pili revealed that PilK, PilM, and PilR are inner membrane proteins, and PilP and PilT are periplasmic proteins. PilO protein was localized to the outer membrane in the presence of other Pil proteins, whereas it was localized to the cytoplasm in the absence of these proteins. Furthermore, the cleavage site of PilP protein was determined by N-terminal amino acid sequencing of purified mature PilP protein. We predict that PilK, PilM, PilO, PilP, and PilT proteins function as the components of the pilin transport apparatus and thin-pilus basal body.