16alpha-bromoacetoxyestradiol 3-メチルエーテルの合成と、ヒト胎盤エストラジオール17beta-dehydrogenaseのステロイド結合部位の研究

均一なエストラジオール17BETA-デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.62）は、アフィニティクロマトグラフィーによってヒト胎盤から調製され、ステロイド結合部位はアフィニティラベルング技術で研究されました。16アルファ - ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルおよび三脚化化合物は、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、ブロモ酢酸または[2-3H]ブロモ酢酸を伴うエストリオール3-メチルエーテルの凝縮により合成されました。16アルファ - ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルは、少なくとも24時間、pH 7.0、25度の0.01 Mリン酸緩衝液で安定しています。生理学的条件下でシステイン、ヒスチジン、メチオニン、リジン、およびトリプトファンをアルキル化します。ステロイドはエストラジオール17beta-dehydrogenaseの基質であるため、ステロイド結合部位に結合する必要があります。150倍モル濃度の16アルファ - ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルによるエストラジオール17BETA-デヒドロゲナーゼの不活性化は、1.5時間のハーフタイムで擬似第一次の速度に続きます。Estradiol-17Beta、Nadh、およびNADPHは、不活性化の速度を遅くします。モル濃度の2-メルカプトエタノール16アルファ - ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルの50倍の濃度は不活性化を止めますが、それを逆転させません。16アルファ - ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルアルキル化NADHとNADPHの両方。少量の酵素の存在は、このアルキル化の速度を著しく増加させます。酵素が16alpha- [2-3H]ブロモアセトキシエストラジオール3-メチルエーテルで不活性化されると、酸加水分解物のアミノ酸分析により、3-カルボキシメチルヒスチジンと1,3-ジカルボキシメチルヒスチジンが明らかになります。28％と51％の不活性化サンプルの比較は、不活性化が進むと3-カルボキシメチルヒスチジンの総量が減少し、1,3-ジカルボキシメチルヒスチジンが増加し、前者が2回目のアルキル化段階で後者に変換されることを示唆しています。酵素が大量のNADPHの存在下で不活性化されると、1,3-ジカルボックスメチルヒスチジンのみが見つかります。本研究から、エストラジオール17BETA-デヒドロゲナーゼは、以前に研究した20beta-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと同様に、活性部位の触媒領域にヒスチジル残基が存在すると結論付けられています。

Homogeneous estradiol 17beta-dehydrogenase (EC 1.1.1.62) was prepared from human placenta by affinity chromatography and the steroid binding site was studied with affinity-labeling techniques. 16alpha-Bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether and the tritated compound were synthesized by condensation of estriol 3-methyl ether with bromoacetic acid or [2-3H]bromoacetic acid in the presence of dicyclohexylcarbodiimide. 16alpha-Bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether is stable in 0.01 M phosphate buffer at pH 7.0, 25 degrees, for at least 24 hours. It alkylates cysteine, histidine, methionine, lysine, and tryptophan under physiological conditions. The steroid is a substrate of estradiol 17beta-dehydrogenase, thus it must bind at the steroid binding site. The inactivation of estradiol 17beta-dehydrogenase by 150-fold molar concentrations of 16alpha-bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether follows pseudo-first order kinetics with a half-time of 1.5 hours. Estradiol-17beta, NADH, and NADPH slow the rate of inactivation. 2-Mercaptoethanol in molar concentrations 50-fold that of 16alpha-bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether stops the inactivation, but does not reverse it. 16alpha-Bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether alkylates both NADH and NADPH; the presence of small amounts of enzyme markedly increases the rate of this alkylation. When the enzyme is inactivated with 16alpha-[2-3H]bromoacetoxyestradiol 3-methyl ether, amino acid analysis of acid hydrolysates reveals 3-carboxymethylhistidine and 1,3-dicarboxymethylhistidine. Comparison of 28 and 51% inactivated samples indicates that, as inactivation proceeds, the total amount of 3-carboxymethylhistidine decreases, while 1,3-dicarboxymethylhistidine increases, suggesting that the former is converted to the latter by a second alkylation step. When the enzyme is inactivated in the presence of a large excess of NADPH, only 1,3-dicarboxymethylhistidine is found. From the present study it is concluded that estradiol 17beta-dehydrogenase has a histidyl residue present in the catalytic region of the active site as does the previously studied 20beta-hydroxysteroid dehydrogenase.