フルオロアラミネートは、p130 CASとFAKのリン酸化を刺激し、脱毛前MC3T3-E1細胞の付着と拡散を増加させます

フルオロアルミネートはGタンパク質活性化因子であり、培養中の骨芽細胞を刺激し、in vivoの骨形成剤です。骨芽細胞における蛍光炭酸塩のGタンパク質媒介作用のメカニズムを解明するために、骨芽球前細胞株MC3T3-E1のタンパク質チロシンリン酸化を研究しました。フルオロアルミネート、リゾホスファチジン酸（LPA; Gタンパク質共役受容体のアゴニスト）、またはI型コラーゲンへの接着はすべて、p130、p120、p110を含む同様のタンパク質のリン酸化を刺激しました（以前は豊富なチロシンキナーゼ2として同定されたものとして同様のタンパク質を刺激しました。、pyk2）、およびp70。これらのタンパク質のリン酸化は、SRC阻害剤に敏感でしたが、Giタンパク質の不活性化因子である百日咳毒素には敏感でした。精製/質量分析により、および免疫透過術により、p130タンパク質は、細胞接着受容体、インテグリンによるシグナル伝達に関与するSRC基質およびタンパク質であるP130 CAS（CRK関連タンパク質）として同定されました。免疫沈降P130 CASのリン酸化は、フルオロアルミン酸塩およびGタンパク質共役受容体のアゴニストによる刺激とともに増加しましたが、成長因子では増加しませんでした。免疫脱毛により、P120タンパク質は焦点接着キナーゼ、FAKとして同定されました。I型コラーゲンへの細胞付着中のフルオロアルミネートの添加は、p130 CAとFAKのリン酸化をさらに刺激しました。同時に、フルオロアラミネートは、付着したMC3T3-E1細胞の数とその拡散を増加させました。細胞培養におけるフルオロアルミネート作用のこれらの新しい側面は、in vivoでのフルオロアルミネートの骨形成作用にとって重要かもしれません。

Fluoroaluminate is a G-protein activator, it stimulates osteoblastic cells in culture, and is a bone-forming agent in vivo. To elucidate the mechanisms of G-protein-mediated action of fluoroaluminate in osteoblasts, we studied protein tyrosine phosphorylation in the preosteoblastic cell line MC3T3-E1. Fluoroaluminate, lysophosphatidic acid (LPA; an agonist for G-protein-coupled receptor), or adhesion to type I collagen all stimulated phosphorylation of a similar set of proteins, including p130, p120, p110 (previously identified as proline-rich tyrosine kinase 2, Pyk2), and p70. The phosphorylation of these proteins was sensitive to an Src inhibitor, but not to a Gi-protein inactivator, pertussis toxin. By purification/mass spectrometry and by immunodepletion, p130 protein was identified as p130 Cas (Crk-associated protein), a Src substrate and a protein involved in signaling by cell-adhesion receptors, integrins. Phosphorylation of immunoprecipitated p130 Cas increased upon stimulation with fluoroaluminate and with agonists of G-protein-coupled receptors, but not with growth factors. By immunodepletion, the p120 protein was identified as focal adhesion kinase, Fak. The addition of fluoroaluminate during cell attachment to type I collagen further stimulated phosphorylation of p130 Cas and of Fak. Simultaneously, fluoroaluminate increased the number of attached MC3T3-E1 cells and their spreading. These novel aspects of fluoroaluminate action in cell culture may be important for the bone-forming action of fluoroaluminate in vivo.