タバコエッチングウイルスプロテアーゼ：野生型触媒能力を備えた安定した変異体の自己分解の機構と合理的な設計

その厳しい配列特異性のため、タバコエッチングウイルス（TEV）からの核包含プロテアーゼの触媒ドメインは、遺伝子組み換え融合タンパク質を切断するための有用な試薬です。しかし、TEVプロテアーゼの深刻な欠点は、特定の部位で容易に切断し、活性が大幅に減少した切り捨てられた酵素を生成することです。自己分析速度は、TEVプロテアーゼの濃度に比例しており、二分子反応メカニズムを意味します。しかし、触媒的に活性なプロテアーゼは、触媒的に不活性なプロテアーゼを切り捨てられた形に変換することができませんでした。触媒的に不活性なプロテアーゼの濃度を固定量の野生型酵素に追加すると、自己活性化速度が加速されました。まとめると、これらの結果は、TEVプロテアーゼの自動分析がプロテアーゼ分子間のアロステリック相互作用によって促進される分子内反応である可能性があることを示唆しています。より安定したプロテアーゼを作成するために、内部切断部位のP2およびP1 '位置でアミノ酸置換を行い、酵素の安定性と触媒活性への影響を評価しました。P1 '変異体の1つであるS219Vは、野生型プロテアーゼ（約100倍）よりもはるかに安定しているだけでなく、より効率的な触媒でもありました。

Because of its stringent sequence specificity, the catalytic domain of the nuclear inclusion protease from tobacco etch virus (TEV) is a useful reagent for cleaving genetically engineered fusion proteins. However, a serious drawback of TEV protease is that it readily cleaves itself at a specific site to generate a truncated enzyme with greatly diminished activity. The rate of autoinactivation is proportional to the concentration of TEV protease, implying a bimolecular reaction mechanism. Yet, a catalytically active protease was unable to convert a catalytically inactive protease into the truncated form. Adding increasing concentrations of the catalytically inactive protease to a fixed amount of the wild-type enzyme accelerated its rate of autoinactivation. Taken together, these results suggest that autoinactivation of TEV protease may be an intramolecular reaction that is facilitated by an allosteric interaction between protease molecules. In an effort to create a more stable protease, we made amino acid substitutions in the P2 and P1' positions of the internal cleavage site and assessed their impact on the enzyme's stability and catalytic activity. One of the P1' mutants, S219V, was not only far more stable than the wild-type protease (approximately 100-fold), but also a more efficient catalyst.