蛍光in situハイブリダイゼーションとフローサイトメトリーによるテロメア長測定：ヒントと落とし穴

背景：染色体の終わりに非コーディングDNAリピートを含むテロメアは、染色体の安定性に不可欠であり、細胞の複製と老化の調節に関与しています。細胞でのテロメア繰り返しの徐々に喪失は、老化と腫瘍の発達に関連しており、テロメアの長さを測定する方法が増加しています。テロメアリピートの長さを測定するための少なくとも3つの方法が記載されています。サザンブロット分析と、デジタル蛍光顕微鏡（Q-fish）またはフローサイトメトリー（フローフィッシュ）のいずれかを使用した定量的蛍光in situハイブリダイゼーション。サザンブロット分析とQ-fishの両方には特定の制限があり、時間がかかりますが、フローフィッシュ技術には比較的少ないセル（10（5））が必要であり、1日で完了できます。フローフィッシュ法のさらなる利点は、個々の細胞からのテロメアの長さに関するデータと、細胞のサブセット（リンパ球および顆粒球）が同じサンプルから獲得できることです。Flow-Fish技術を使用して正確で再現可能な結果を得るために、テロメア長値に対するプロトコルのさまざまなステップの影響を体系的に調査し、最も重要なパラメーターに対して許容可能な範囲を確立しました。 方法：全血からの分離された白血球は、熱と70％/75％のホルムアミドによって変性され、テロメア特異的フルオレセインイソチオサンテ（FITC）結合ペプチド核酸プローブ（PNA）の有無にかかわらずハイブリダイズします。未結合のテロメアPNAを洗い流し、DNAを対比染色し、テロメア蛍光をArgonイオンレーザー（488 nm）を使用してFITCを励起したフローサイトメーターで測定します。各サンプルについて、テロメアPNA染色および染色されていないチューブの複製が分析されます。 結果：細胞数とフローフィッシュテロメア長の測定は、人間および他の種の白血球と胸腺細胞で行われました。白血球懸濁液は、塩化アンモニウムを使用した2つの赤血球溶解段階によって調製されました。DNAの最適な変性は、70％/75％のホルムアミドを含む溶液で85〜87度Cで15分間加熱することにより達成されました。ハイブリダイゼーションは、0.3マイクログ/mLテロメアPNAプローブで少なくとも60〜90分間、室温で行われました。未結合のテロメアPNAプローブは、室温で70％/75％のホルムアミドを含む洗浄ステップで、少なくとも4,000〜40,000回希釈しました。LDS 751とDAPIは、テロメア長測定との有意な干渉を示さなかったため、DNAの対比段階として適していました。 結論：核形成された血液細胞におけるテロメア長測定のためにフローフィッシュを使用するには、最適化されたプロトコルに密接な順守が必要です。ここで説明する方法は、核形成された血液細胞のサブセットのテロメア長を迅速に決定するために使用できます。

BACKGROUND: Telomeres containing noncoding DNA repeats at the end of the chromosomes are essential for chromosomal stability and are implicated in regulating the replication and senescence of cells. The gradual loss of telomere repeats in cells has been linked to aging and tumor development and methods to measure telomere length are of increasing interest. At least three methods for measuring the length of telomere repeats have been described: Southern blot analysis and quantitative fluorescence in situ hybridization using either digital fluorescence microscopy (Q-FISH) or flow cytometry (flow-FISH). Both Southern blot analysis and Q-FISH have specific limitations and are time-consuming, whereas the flow-FISH technique requires relatively few cells (10(5)) and can be completed in a single day. A further advantage of the flow-FISH method is that data on the telomere length from individual cells and subsets of cells (lymphocytes and granulocytes) can be acquired from the same sample. In order to obtain accurate and reproducible results using the flow-FISH technique, we systematically explored the influence of various steps in the protocol on telomere length values and established an acceptable range for the most critical parameters. METHODS: Isolated leukocytes from whole blood are denatured by heat and 70%/75% formamide, then hybridized with or without a telomere-specific fluorescein isothiocyante (FITC)-conjugated peptide nucleic acid probe (PNA). Unbound telomere PNA is washed away, the DNA is counterstained, and telomere fluorescence is measured on a flow cytometer using an argon ion laser (488 nm) to excite FITC. For each sample, duplicates of telomere PNA-stained and unstained tubes are analyzed. RESULTS: Cell counts and flow-FISH telomere length measurements were performed on leukocytes and thymocytes of humans and other species. Leukocyte suspensions were prepared by two red blood cell lysis steps with ammonium chloride. Optimal denaturation of DNA was achieved by heating at 85-87 degrees C for 15 min in a solution containing 70%/75% formamide. Hybridization was performed at room temperature with a 0.3 microg/ml telomere-PNA probe for at least 60-90 min. Unbound telomere-PNA probe was diluted at least 4,000-40,000 times with wash steps containing 70%/75% formamide at room temperature. LDS 751 and DAPI were suitable as DNA counterstains as they did not show significant interference with telomere length measurement. CONCLUSIONS: The use of flow-FISH for telomere length measurements in nucleated blood cells requires tight adherence to an optimized protocol. The method described here can be used to determine rapidly the telomere length in subsets of nucleated blood cells.