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免疫センサーの決定的な感度と特異性は別として、使用された抗体は、センサーチップやセンサーの安定性の製造コストなどの追加の重要な要因に基本的に寄与します。組換え抗体断片の生産スキームは、バイオセンサー開発のこれらの特定の問題に関して最適化されています。Phagemid Vector Pcantab 5 Eは、対応するライブラリからの抗体フラグメントの選択に広く使用されています。ただし、選択されたシングルチェーンF（V）（SCFV）フラグメントの大規模生産は、インデューサーIPTGおよび抗E-TAG抗体の高いコストによって実質的に制限されています。後者は、組換えタンパク質の精製のためにかなりの量で必要です。f（ab）フラグメントの発現のために、pcantab 5 eからプラスミドpask85にSCFV変数領域をサブクローニングするための一般的な戦略が確立されました。Pask85は、一定の重鎖ドメインのカルボキシル末端にあるHis（6）タグを含むマウス定数ドメインのコードシーケンスをベアル化します。抗S-トリアジン抗体K47Hは、この研究でモデルシステムとして機能しました。高細胞密度発酵槽でのF（ab）フラグメントの生合成は、アニヒドロテトラサイクリンの添加により誘導されました。その後、F（AB）フラグメントは、固定化された金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）によって単一のステップで、ペリプラズム抽出物から精製されました。標準的な発酵スキームを使用して、100マイクログ/LXOD（550）精製F（AB）フラグメントの収量が得られました。F（AB）の感度と交差反応性は、酵素免疫測定法によってアッセイされた場合、親SCFVに匹敵しました。ただし、F（AB）フラグメントは、長期の安定性が大幅に改善されたことを示しました。
免疫センサーの決定的な感度と特異性は別として、使用された抗体は、センサーチップやセンサーの安定性の製造コストなどの追加の重要な要因に基本的に寄与します。組換え抗体断片の生産スキームは、バイオセンサー開発のこれらの特定の問題に関して最適化されています。Phagemid Vector Pcantab 5 Eは、対応するライブラリからの抗体フラグメントの選択に広く使用されています。ただし、選択されたシングルチェーンF（V）（SCFV）フラグメントの大規模生産は、インデューサーIPTGおよび抗E-TAG抗体の高いコストによって実質的に制限されています。後者は、組換えタンパク質の精製のためにかなりの量で必要です。f（ab）フラグメントの発現のために、pcantab 5 eからプラスミドpask85にSCFV変数領域をサブクローニングするための一般的な戦略が確立されました。Pask85は、一定の重鎖ドメインのカルボキシル末端にあるHis（6）タグを含むマウス定数ドメインのコードシーケンスをベアル化します。抗S-トリアジン抗体K47Hは、この研究でモデルシステムとして機能しました。高細胞密度発酵槽でのF（ab）フラグメントの生合成は、アニヒドロテトラサイクリンの添加により誘導されました。その後、F（AB）フラグメントは、固定化された金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）によって単一のステップで、ペリプラズム抽出物から精製されました。標準的な発酵スキームを使用して、100マイクログ/LXOD（550）精製F（AB）フラグメントの収量が得られました。F（AB）の感度と交差反応性は、酵素免疫測定法によってアッセイされた場合、親SCFVに匹敵しました。ただし、F（AB）フラグメントは、長期の安定性が大幅に改善されたことを示しました。
Apart from the decisive sensitivity and specificity of immunosensors, the employed antibodies essentially contribute to additional key factors like fabrication costs for sensor chips and sensor stability. A production scheme for recombinant antibody fragments has been optimised with respect to these particular issues of biosensor development. The phagemid vector pCANTAB 5 E is widely used for the selection of antibody fragments from corresponding libraries. However, large-scale production of the selected single-chain F(v) (scFv) fragments is substantially restricted by the high cost for the inducer IPTG and the anti-E-tag antibody. The latter is needed in significant amounts for the purification of the recombinant protein. A generic strategy was established for subcloning scFv variable regions from pCANTAB 5 E into the plasmid pASK85 for the expression of F(ab) fragments. pASK85 bears coding sequences for murine constant domains including a His(6) tag at the carboxyl-terminal end of the constant heavy chain domain. The anti-s-triazine antibody K47H served as a model system in this study. Biosynthesis of the F(ab) fragment in a high cell density fermenter was induced by addition of anhydrotetracycline. The F(ab) fragment was subsequently purified from the periplasmic extract in a single step by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). A yield of 100 microg/lxOD(550) purified F(ab) fragment was obtained employing a standard fermentation scheme. The sensitivity and cross-reactivity of the F(ab) was comparable to the parent scFv when assayed by enzyme immunoassay. However, the F(ab) fragment exhibited significantly improved long-term stability.
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