堅牢な誘導性再圧性プロモーターは、四hymenaThermophilaにおける遺伝子ノックアウト、条件付き発現、および相同および異種遺伝子の過剰発現を大幅に促進します

CD（2+） - 誘導性メタロチオネイン（MTT1）遺伝子は、Tetrahymena Thermophilaからクローン化されました。ノーザンブロット分析により、MTT1 mRNAはCD（2+）の非存在下では検出できず、添加から10分以内に誘導され、その濃度に比例して発現し、その撤退時に急速に消失することが示されました。同様に、MTT1遺伝子の非コード配列に隣接するNeo1遺伝子コーディング領域をMTT1遺伝子座を破壊するために使用した場合、CD（2+）の非存在下で形質転換体は観察されず、形質転換体の数はCDの増加に比例しませんでした（2+） 集中。MTT1プロモーターが以前に使用したNEO2カセットのヒストン遺伝子HHF1プロモーターを置き換えたNeo3カセットは、NEO2よりもはるかに高い周波数で細胞を変換し、NEO2が故障した生殖細胞ノックアウトを生成しました。MTT1遺伝子座に挿入されたGTU1遺伝子を備えたノックアウトヘテロカリオンのガンマ - チューブリン遺伝子の交配の子孫を救出すると、野生型GTU1遺伝子自体で救助するよりも75倍以上の形質転換体が得られました。MTT1-GTU1キメラ遺伝子で救助された細胞をCD（2+）を欠く培地に移したとき、それらは成長を止め、GTU1遺伝子のみを含む細胞と区別できない表現型の変化を持っていました。したがって、現在、条件付き致死変異体を生成し、内因性遺伝子をMTT1プロモーターの制御下にあるものに置き換えることにより、必須遺伝子のヌル変異の末端表現型を研究することができます。MTT1プロモーターはまた、高度に発現したBTU1プロモーターよりも繊毛魚寄生虫Ichthyophthirius多項目のIAG48 [G1]表面抗原遺伝子の約30倍の過剰発現をもたらし、総細胞タンパク質の約1％を占めました。したがって、MTT1プロモーターは、テトラヒメナの内因性および外来遺伝子の日常的な過剰発現を可能にする必要があります。

The Cd(2+)-inducible metallothionein (MTT1) gene was cloned from Tetrahymena thermophila. Northern blot analysis showed that MTT1 mRNA is not detectable in the absence of Cd(2+), is induced within 10 min of its addition, is expressed in proportion to its concentration, and rapidly disappears upon its withdrawal. Similarly, when the neo1 gene coding region flanked by the MTT1 gene noncoding sequences was used to disrupt the MTT1 locus, no transformants were observed in the absence of Cd(2+), and the number of transformants was proportional to increased Cd(2+) concentration. The neo3 cassette, in which the MTT1 promoter replaced the histone gene HHF1 promoter of the previously used neo2 cassette, transformed cells at much higher frequencies than neo2 and produced germ-line knockouts where neo2 had failed. Rescuing the progeny of a mating of gamma-tubulin gene, GTU1, knockout heterokaryons with a GTU1 gene inserted into the MTT1 locus yielded >75 times more transformants than rescuing with the wild-type GTU1 gene itself. When cells rescued with the MTT1-GTU1 chimeric gene were transferred to medium lacking Cd(2+), they stopped growing and had phenotypic changes indistinguishable from cells containing only disrupted GTU1 genes. Thus, it is now possible to create conditional lethal mutants and study the terminal phenotypes of null mutations for essential genes by replacing the endogenous gene with one under the control of the MTT1 promoter. The MTT1 promoter also resulted in approximately 30 times more overexpression of the IAG48[G1] surface antigen gene of the ciliate fish parasite Ichthyophthirius multifiliis than the highly expressed BTU1 promoter, accounting for approximately 1% of the total cell protein. Thus, the MTT1 promoter should enable routine over-expression of endogenous and foreign genes in Tetrahymena.