メカノセンシティブチャネル、熱プラズマ、細胞壁のない古細菌：クローニングと分子の特性評価

洗剤溶解膜タンパク質をリポソームに再構成する機能的アプローチを使用し、パッチクランプ実験で機能に従うことにより、好熱性細胞の壁のないアルケオン熱形成腫火山の新規メカニック感受性（MS）チャネルを特定しました。濃縮タンパク質画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、大幅なコンダクタンスの細菌MSチャネルであるMSCLに匹敵する約15 kDAの帯域を明らかにしました。タンパク質の微小シーケンスによって決定された20のN末端残基は、関連する種の熱形成感酸性菌のゲノムにおける未知のオープンリーディングフレームとシーケンスを一致させました。T.酸性菌遺伝子によってコードされたタンパク質をクローン化し、大腸菌で発現させ、リポソームに再構成しました。機能について調べた場合、再構成されたタンパク質は、MSイオンチャネルに典型的な特性を示しました。1）パッチクランプピペットに適用される負圧による活性化、2）ガドリニウムによる詰まり、および3）アニオン圧hipathトリニトロフェノールによる活性化。細菌のMSチャネルに使用される命名法と類似して、T酸性菌のMSチャネルはMSCTAと呼ばれていました。二次構造解析により、MSCLと同様に、T。adisophilumMSタンパク質は2つの膜貫通ドメインを持っている可能性があり、2つの膜に広がる領域を持つ構造的に関連するMSCL様イオンチャネルのファミリーに属していることを示唆しています。MSCTA遺伝子がMSCl-ノックアウト株とリポソームに再構成されたMSCTAタンパク質で発現した場合、MSCTAのゲーティングは、可変コンダクタンスの非常に短い開口部によって特徴付けられました。対照的に、MSCTA遺伝子が大腸菌の野生型MSCL+株で発現した場合、チャネルのゲーティング特性はMSCLに似ていました。しかし、チャネルはコンダクタンスを減少させ、その動態および活性化の自由エネルギーにおいてMSCLとは異なり、MSCTAとMSCLが機能的複合体を形成したり、互いの活動を調節することができることを示唆しています。MSCLと同様に、MSCTAは、より短いアシル鎖を有するリン脂質で作られたリポソームで活性の増加を示し、原核生物MSチャネルの機能における疎水性ミスマッチの役割を示唆しています。

By using a functional approach of reconstituting detergent-solubilized membrane proteins into liposomes and following their function in patch-clamp experiments, we identified a novel mechanosensitive (MS) channel in the thermophilic cell wall-less archaeon Thermoplasma volcanium. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the enriched protein fractions revealed a band of approx 15 kDa comparable to MscL, the bacterial MS channel of large conductance. 20 N-terminal residues determined by protein microsequencing, matched the sequence to an unknown open reading frame in the genome of a related species Thermoplasma acidophilum. The protein encoded by the T. acidophilum gene was cloned and expressed in Escherichia coli and reconstituted into liposomes. When examined for function, the reconstituted protein exhibited properties typical of an MS ion channel: 1) activation by negative pressure applied to the patch-clamp pipet, 2) blockage by gadolinium, and 3) activation by the anionic amphipath trinitrophenol. In analogy to the nomenclature used for bacterial MS channels, the MS channel of T acidophilum was termed MscTA. Secondary structural analysis indicated that similar to MscL, the T. acidophilum MS protein may have two transmembrane domains, suggesting that MS channels of thermophilic Archaea belong to a family of structurally related MscL-like ion channels with two membrane-spanning regions. When the mscTA gene was expressed in the mscL- knockout strain and the MscTA protein reconstituted into liposomes, the gating of MscTA was characterized by very brief openings of variable conductance. In contrast, when the mscTA gene was expressed in the wild-type mscL+ strain of E. coli, the gating properties of the channel resembled MscL. However, the channel had reduced conductance and differed from MscL in its kinetics and in the free energy of activation, suggesting that MscTA and MscL can form functional complexes and/or modulate each other activity. Similar to MscL, MscTA exhibited an increase in activity in liposomes made of phospholipids having shorter acyl chain, suggesting a role of hydrophobic mismatch in the function of prokaryotic MS channels.