クレノウフラグメントの3'-5 'エキソヌクレアーゼ：エキソヌクレル溶解および二重DNA溶融における一本鎖DNA結合領域内のアミノ酸残基の役割

DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントの3'-5 'エキソヌクレアーゼ活性のメカニズムは、生化学的技術と分光技術の組み合わせで調査されています。部位指向の突然変異誘発を使用して、肥料のホスホジエステル結合の5 '側のDNA基質と相互作用する側鎖のアラニン置換を行いました。エキソヌクレアーゼ反応における選択された側鎖の役割をプローブするために、各変異タンパク質について、単一鎖および二本鎖DNA基質の3'-5 'エキソヌクレアーゼ切断の速度論的パラメーターを決定しました。結果は、最後から2番目のヌクレオチド（Q419、N420、およびY423）と相互作用する側鎖が、活性部位でDNA基質を固定したり、硬化性リン酸の適切なジオメトリを確保するために重要であることを示しています。対照的に、DNA末端（K422およびR455）の3番目のヌクレオチドと相互作用する側鎖は、一本鎖DNAのエキソヌクレアーゼ切断に直接関与していません。Q419、Y423、およびR455のアラニン置換は、一本鎖および二本鎖DNAの切断に著しく異なる影響を及ぼし、二重基質の場合にははるかに大きな活性の損失を引き起こします。ダンシル標識プライマー/テンプレートを使用した時間分解蛍光異方性減衰測定は、Q419A、Y423A、およびR455A変異がクレノウフラグメントの能力を破壊し、エクスリース部位で凍結したティルミヌスを結合することを示しています。対照的に、N420A変異は、二重末端のエキソヌクレアーゼ部位への結合を安定化し、N420側鎖が結合DNA基質に株を導入することにより3'-5 'エキソヌクレアーゼ反応を促進することを示唆しています。一緒に、これらの結果は、末端から2番目または3番目のヌクレオチドと相互作用するタンパク質側鎖が、活性部位の基質を固定するか、硬性リン酸塩の適切なジオメトリを確保することにより、エキソヌクレアーゼ反応の化学的ステップの両方に関与できることを示しています。二重鎖DNA加水分解の事前ゼミカルステップでは、二重融解を促進することにより。

The mechanism of the 3'-5' exonuclease activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I has been investigated with a combination of biochemical and spectroscopic techniques. Site-directed mutagenesis was used to make alanine substitutions of side chains that interact with the DNA substrate on the 5' side of the scissile phosphodiester bond. Kinetic parameters for 3'-5' exonuclease cleavage of single- and double-stranded DNA substrates were determined for each mutant protein in order to probe the role of the selected side chains in the exonuclease reaction. The results indicate that side chains that interact with the penultimate nucleotide (Q419, N420, and Y423) are important for anchoring the DNA substrate at the active site or ensuring proper geometry of the scissile phosphate. In contrast, side chains that interact with the third nucleotide from the DNA terminus (K422 and R455) do not participate directly in exonuclease cleavage of single-stranded DNA. Alanine substitutions of Q419, Y423, and R455 have markedly different effects on the cleavage of single- and double-stranded DNA, causing a much greater loss of activity in the case of a duplex substrate. Time-resolved fluorescence anisotropy decay measurements with a dansyl-labeled primer/template indicate that the Q419A, Y423A, and R455A mutations disrupted the ability of the Klenow fragment to melt duplex DNA and bind the frayed terminus at the exonuclease site. In contrast, the N420A mutation stabilized binding of a duplex terminus to the exonuclease site, suggesting that the N420 side chain facilitates the 3'-5' exonuclease reaction by introducing strain into the bound DNA substrate. Together, these results demonstrate that protein side chains that interact with the second or third nucleotides from the terminus can participate in both the chemical step of the exonuclease reaction, by anchoring the substrate in the active site or by ensuring proper geometry of the scissile phosphate, and in the prechemical steps of double-stranded DNA hydrolysis, by facilitating duplex melting.