UDP-ガラクトースのde novo産生のための生合成経路を組み合わせて：アガロースビーズに固定化された複数の酵素との触媒

糖ヌクレオチドの再生は、オリゴ糖の形成のための生合成経路の重要なステップです。糖ヌクレオチドの産生の困難を緩和するために、ウリジン二リン酸ガラクトース（UDP-ガラクトース）を産生する方法を開発しました。7つの酵素を含む組み合わせた生合成経路は、3つの部分で構成されています。I）ガラクトースからUDPガラクトースを形成する主な経路、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、UDP-グルコースピロスホリラーゼ、および無性ガンピウロスファ皮酵母とII）ウリジン一リン酸（UMP）キナーゼとヌクレオチド二リン酸キナーゼ、およびIIIによって触媒されるウリジン三リン酸供給経路、およびエネルギー資源として添加されたポリホスホン酸キナーゼによって触媒されるアデノシン三リン酸（ATP）再生経路。すべての酵素は、個別に発現し、ヘキサヒスチジンタグを介してニッケルアガロースビーズ（「スーパービーズ」）に固定されました。この反応には、化学量論的な量のUMPとガラクトース、およびATPとグルコース1-リン酸の触媒量、すべて安価な出発材料が必要です。スーパービードカラムを介した反応混合物の連続循環48時間後、UMPの50％をUDPガラクトースに変換しました。結果は、固定化された酵素の安定性のため、スーパービードカラムでのUDPガラクトースのde novo産生が溶液よりも効率的であることを示しています。

Regeneration of sugar nucleotides is a critical step in the biosynthetic pathway for the formation of oligosaccharides. To alleviate the difficulties in the production of sugar nucleotides, we have developed a method to produce uridine diphosphate galactose (UDP-galactose). The combined biosynthetic pathway, which involves seven enzymes, is composed of three parts: i) the main pathway to form UDP-galactose from galactose, with the enzymes galactokinase, galactose-1-phosphate uridyltransferase, UDP-glucose pyrophosphorylase, and inorganic pyrophosphatase, ii) the uridine triphosphate supply pathway catalyzed by uridine monophosphate (UMP) kinase and nucleotide diphosphate kinase, and iii) the adenosine triphosphate (ATP) regeneration pathway catalyzed by polyphosphate kinase with polyphosphate added as an energy resource. All of the enzymes were expressed individually and immobilized through their hexahistidine tags onto nickel agarose beads ("super beads"). The reaction requires a stoichiometric amount of UMP and galactose, and catalytic amounts of ATP and glucose 1-phosphate, all inexpensive starting materials. After continuous circulation of the reaction mixture through the super-bead column for 48 h, 50 % of the UMP was converted into UDP-galactose. The results show that de novo production of UDP-galactose on the super-bead column is more efficient than in solution because of the stability of the immobilized enzymes.