合理的なタンパク質工学によるリパーゼのエナンチオ選択性の改善

リパーゼの活性部位におけるアルコールエナンチオマーの2つの異なる結合モードに基づくモデルにより、そのエナンチオ選択性の合理的な再設計が可能になりました。1-ハロ-2-オクタノールは、カンジダ南極リパーゼBによって不十分に分解されました。基質とリパーゼ間の相互作用を分子モデリングで調査しました。不利な相互作用は、高速反応性エナンチオマーのハロゲン部分と、活性部位の底部に位置する領域（Stereoselectivity Pocket）の間に見られました。リパーゼはこの領域で事実上変異しており、いくつかのバリアントのエネルギー輪郭マップは、標的基板に対してより良い相互作用を示しました。リパーゼの4つの選択されたバリアントが産生され、これらの変異体で運動分解能実験が行われました。単一点変異により、エナンチオ選択性が2倍になった1つのバリアントと、ターゲットハロヒドリンに対するエナンチオ選択性が消滅した1つのバリアントが生じました。立体選択性ポケットの体積の増加により、エナンチオ選択性が低下し、静電電位の変化はエナンチオ選択性の増加を引き起こしました。他の種類のアルコールに対するこれらの新しいリパーゼバリアントのエナンチオ選択性も調査されました。突然変異によって引き起こされるエナンチオ選択性の変化は、このリパーゼによるアルコールエナンチオマーのキラル認識に関する提案されたモデルとよく一致していました。

A model based on two different binding modes for alcohol enantiomers in the active site of a lipase allowed rational redesign of its enantioselectivity. 1-Halo-2-octanols were poorly resolved by Candida antarctica lipase B. Interactions between the substrates and the lipase were investigated with molecular modeling. Unfavorable interactions were found between the halogen moiety of the fast-reacting S enantiomer and a region situated at the bottom of the active site (stereoselectivity pocket). The lipase was virtually mutated in this region and energy contour maps of some variants displayed better interactions for the target substrates. Four selected variants of the lipase were produced and kinetic resolution experiments were undertaken with these mutants. Single point mutations gave rise to one variant with doubled enantioselectivity as well as one variant with annihilated enantioselectivity towards the target halohydrins. An increased volume of the stereoselectivity pocket caused a decrease in enantioselectivity, while changes in electrostatic potential increased enantioselectivity. The enantioselectivity of these new lipase variants towards other types of alcohols was also investigated. The changes in enantioselectivity caused by the mutations were well in agreement with the proposed model concerning the chiral recognition of alcohol enantiomers by this lipase.