ミトコンドリア転写因子A（TFAM）のラット遺伝子の5'Flanking領域の特性評価

ミトコンドリア転写因子A（TFAM）は、転写の開始とミトコンドリアDNA（mtDNA）の複製に不可欠です。ラットTFAM遺伝子の5'アップストリーム領域は、PCRベースのゲノムウォーカーを使用して新たに同定されたTFAM cDNAの5 '配列を拡張することにより、ラットゲノムDNAから分離されました。同定されたラットTFAM遺伝子は、ヒトTFAMの上流領域とほとんど配列相同性を示しませんでした。典型的なTATAまたは潜在的な核呼吸因子1（NRF-1）結合部位は見つかりませんでしたが、SP1の3つの潜在的な結合部位とNRF-2の1つは近位上流領域に存在しました。TFAM 5'-upstream領域のトランスフェクションは、ルシフェラーゼにラット骨格筋L6細胞に結合し、プロモーター活性がコントロールベクターの活性よりも10倍高いことを示しました。NRF-1コンセンサス結合シーケンスがないにもかかわらず、ヒトNRF-1発現ベクターの同時トランスフェクションはTFAMプロモーター活性を2倍に増加させました。NRF-1のゲル移動シフトアッセイは、NRF-1が-112から+49の間のプロモーターの近位領域に結合できることを実証しました。50 mMグルコースを24時間添加すると、TFAMプロモーター活性が最大2倍増加しましたが、24時間の100ミクロムH（2）O（2）は、活性をコントロールの40％に抑制しました。これらの結果から、ここで示されているシーケンスは本物のラットTFAMプロモーターのシーケンスであり、mtDNA転写と複製の研究で有用であることが証明されることが期待されています。

Mitochondrial transcription factor A (Tfam) is essential for the initiation of transcription and the replication of mitochondrial DNA (mtDNA). The 5'-upstream region of the rat Tfam gene was isolated from rat genomic DNA by extending the 5' sequence of newly identified Tfam cDNA using PCR-based Genome Walker. The identified rat Tfam gene showed little sequence homology with the upstream region of human Tfam. No typical TATA or potential nuclear respiratory factor 1 (NRF-1) binding site was found, whereas three potential binding sites for Sp1 and one for NRF-2 were present in the proximal upstream region. Transfection of the Tfam 5'-upstream region ligated to luciferase into rat skeletal muscle L6 cells demonstrated that the promoter activity was 10 times higher than that of control vectors. Despite the absence of the NRF-1 consensus binding sequence, co-transfection of human NRF-1 expression vector increased the Tfam promoter activity 2-fold. The gel mobility shift assays for NRF-1 demonstrated that NRF-1 could bind to the proximal region of the promoter between -112 and +49. The addition of 50 mM glucose for 24 h increased Tfam promoter activity by up to 2-fold, but 100 microM H(2)O(2) for 24 h repressed the activity to 40% of the control. From these results, the sequence presented here is that of authentic rat Tfam promoter and it is hoped that it will prove useful in studies of mtDNA transcription and replication.